李麗芳，陳露西，賈順姬，顏光玗

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，發(fā)育生物學(xué)教研室，廣州 510515； 2. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084)

TGF-β超家族參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡，在胚胎發(fā)生以及組織器官穩(wěn)態(tài)維持的過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1]。TGF-β信號(hào)傳遞可以通過(guò)SMAD信號(hào)通路[2]和/或DAXX信號(hào)通路[3]。SMAD信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過(guò)膜外的TGF-β 配體結(jié)合位于膜上的TGF-βII 型受體，活化的TGF-βII型受體招募、結(jié)合并磷酸化TGF-βI型受體，激活的TGF-βI型受體磷酸化下游的受體調(diào)控型Smads(R-Smads)，磷酸化的R-Smads與Smad4形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核，與各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)[4]。哺乳動(dòng)物中，R-Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8，這些蛋白包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，MH1和MH2。N端的MH1結(jié)構(gòu)域主要與DNA結(jié)合，C端的MH2結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨プ鞯鞍椎慕Y(jié)合至關(guān)重要[5]。TGF-β 超家族包括TGFβ1、TGFβ12、TGFβ13、激活素(activins)、抑制素(inhibins)、Nodal、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和生長(zhǎng)分化因子(GDFs)等[1]，其中Nodal信號(hào)在脊椎動(dòng)物中內(nèi)胚層誘導(dǎo)、神經(jīng)誘導(dǎo)和神經(jīng)板的前后分化、左右不對(duì)稱以及背腹軸的形成過(guò)程中具有非常重要的作用[6]。Nodal信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于下游效應(yīng)因子Smad2和Smad3。在小鼠中，Smad2缺失的小鼠不能形成前端內(nèi)臟內(nèi)胚層(AVE)[7]，不能形成A-P軸[8]。smad3突變小鼠體型偏小，有前肢畸形的表型[9]，存在黏膜免疫缺陷，但仍可存活至成年[10]。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中smad3缺失導(dǎo)致其不能形成Smad-DNA復(fù)合物，進(jìn)而不能響應(yīng)TGF-β信號(hào)，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[9]。smad2和smad3雙純合突變體不能形成中胚層和進(jìn)行原腸作用[11]。在斑馬魚中，目前沒(méi)有smad2/3純合突變體，但表達(dá)其顯性抑制形式(dnsmad2、dnsmad3a和dnsmad3b)會(huì)導(dǎo)致中內(nèi)胚層發(fā)育缺陷，過(guò)表達(dá)smad3會(huì)促進(jìn)神經(jīng)誘導(dǎo)以及神經(jīng)外胚層的后部化[12]。目前這些研究主要集中在Smad2和Smad3在中內(nèi)胚層誘導(dǎo)以及前后軸線形成中的作用，但Smad2/3是否在神經(jīng)嵴的發(fā)育過(guò)程中起作用，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

神經(jīng)嵴起源于神經(jīng)外胚層和表皮外胚層交界的雙側(cè)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)神經(jīng)外胚層匯聚到中線形成神經(jīng)管后，神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，在沿著神經(jīng)管的背外側(cè)形成一個(gè)離散的間充質(zhì)細(xì)胞群，隨后以固定的時(shí)間和空間模式向特定組織部位遷移，最終形成多種分化的細(xì)胞類型，包括周圍神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、色素細(xì)胞和顱面骨骼細(xì)胞等[13]。神經(jīng)嵴細(xì)胞的誘導(dǎo)發(fā)生主要受到BMP、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、Wnt、Notch等多種信號(hào)的調(diào)節(jié)[14]。這些信號(hào)以及其他轉(zhuǎn)錄因子，共同組成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控神經(jīng)嵴的早期誘導(dǎo)發(fā)生、神經(jīng)嵴祖細(xì)胞的維持、神經(jīng)嵴祖細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換以及通過(guò)不同通路向特定細(xì)胞的分化過(guò)程等。其中，F(xiàn)oxd3和Snail在早期誘導(dǎo)完成到神經(jīng)嵴邊界祖細(xì)胞確定過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)其與Sox9共同在神經(jīng)嵴祖細(xì)胞多能性維持以及祖細(xì)胞從神經(jīng)管分離過(guò)程有一定的功能。此外，Sox9還與Sox10在神經(jīng)嵴細(xì)胞終末分化過(guò)程中有作用[15]。這些轉(zhuǎn)錄因子是神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)記基因，僅在遷移前神經(jīng)嵴細(xì)胞中表達(dá)[16]。與這些基因不同，crestin在神經(jīng)嵴前體細(xì)胞以及分化細(xì)胞中均有表達(dá)，其可以被用來(lái)較靈敏地評(píng)估神經(jīng)嵴細(xì)胞或多或少的變化[13]。

目前，有一些研究結(jié)果提示Smad2以及Smad3可能在神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育中存在一定的功能，如：斑馬魚胚胎中smad3a在遷移的軀干神經(jīng)嵴細(xì)胞中表達(dá)[17]，小鼠胚胎中smad2雜合突變可導(dǎo)致顱面缺損[18]等。本研究以斑馬魚作為模式動(dòng)物，利用嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(antisense morpholino oligonucleotide，MO)技術(shù)敲降斑馬魚smad2和smad3基因的表達(dá),通過(guò)原位雜交檢測(cè)神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)初步探究Smad2/3在神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)中所用到的斑馬魚品系為Tuebingen(TU)。野生型胚胎置于Holtfreter水(0.025 g/L 碳酸氫鈉，0.1 g/L 無(wú)水氯化鈣，0.05 g/L 氯化鉀，3.5 g/L 氯化鈉，pH 值 6.8～7.2)中，于28.5℃培養(yǎng)至特定時(shí)期。

1.1.2 主要試劑和儀器

RNeasy Mini純化回收試劑盒(Qiagen，# 74104，美國(guó))，DNA純化回收試劑盒(# DP214，天跟生化科技有限公司，北京)，GoScript 隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，# A2790，北京照生萊博商貿(mào)有限公司)，mMESSAGE mMACHINE T7/SP6轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Ambion，# AM1345/AM1340，美國(guó))，地高辛標(biāo)記RNA試劑盒(Roche，# 11175025910，美國(guó))，BamH Ι(NEB，# R3136S，美國(guó))，Not Ι(NEB，# R3189S，美國(guó)), 封閉劑(Roche，# 11096176001美國(guó))，左旋咪唑(Sigma，# 16595-80-5，美國(guó))，地高辛抗體(Roche，# 11093274910)，BM Purple AP(Roche，# 11442074001，美國(guó))，徠卡體視顯微鏡(M125 C，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)smad2的前體mRNA序列設(shè)計(jì)2個(gè)反義寡核苷酸，其中MO1序列位于第4個(gè)外顯子和第4個(gè)內(nèi)含子的交接處，MO2序列位于第4個(gè)內(nèi)含子和第5個(gè)外顯子交接處。序列分別為smad2-MO1(簡(jiǎn)稱smad2 SM1)：5’-CAATTTCCATACCTGGTG TCTCCAC-3’，smad2-MO2(簡(jiǎn)稱smad2 SM2)：5’-AAGAACTACAGGAGAGAAGATTAAA-3’。MO由GeneTools公司合成，合成好的MO粉末用無(wú)核酸酶的純水溶解成20 μg/μL的貯液，-80℃凍存。使用時(shí)將MO稀釋到合適濃度進(jìn)行顯微注射。smad3a/bMO和p53 MO的序列和信息詳見(jiàn)已報(bào)道的文獻(xiàn)[12]。

1.2.2 檢測(cè)MO效率的引物設(shè)計(jì)

根據(jù)斑馬魚smad2基因的核酸序列，分別在MO所在區(qū)域的上下游約150 bp處設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。同時(shí)為了確定smad2 SM1和smad2 SM2共同注射是否會(huì)使得敲降效率更高，上游引物設(shè)計(jì)在第3個(gè)外顯子，下游引物位于第6個(gè)外顯子。陽(yáng)性對(duì)照引物位于第2個(gè)外顯子上。序列信息如表1所示。

1.2.3 胚胎總RNA的提取和cDNA的合成

本研究使用RNeasy Mini試劑盒提取胚胎總RNA，其后使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。提取總RNA需取15～30枚處于6體節(jié)時(shí)期經(jīng)過(guò)不同處理的胚胎，用蛋白酶脫去絨毛膜，再用DEPC水清洗兩次后，加入600 μL 裂解液RLT和 24 μL 二硫蘇糖醇(DTT，1 mol/L)，渦旋振蕩使細(xì)胞充分裂解，直至無(wú)肉眼明顯可見(jiàn)的顆粒。后續(xù)的詳細(xì)步驟以及cDNA合成步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書。

表1 smad2 MO有效性驗(yàn)證的引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences for smad2 MO validity detection

1.2.4 體外合成mRNA及純化回收

用于體外合成casmad2 mRNA和smad3amRNA的質(zhì)粒信息詳見(jiàn)之前的報(bào)道[12, 19]。提取12 μg質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，純化后獲得線性化DNA模板，然后體外合成mRNA，并將mRNA純化回收，于-80℃保存。體外合成mRNA及mRNA的純化回收的具體步驟參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書。

1.2.5 MO和mRNA的顯微注射

smad2 SM1的注射劑量為5 ng，SM2的注射劑量為5 ng；smad3a/bMO的注射劑量均為5 ng；p53 MO的注射劑量為5 ng；casmad2 mRNA的注射劑量為5 pg；smad3amRNA的注射劑量為20 pg。將合成的MO及mRNA注射到斑馬魚單細(xì)胞時(shí)期的受精卵中，待胚胎發(fā)育至6體節(jié)時(shí)，用蛋白酶脫去絨毛膜，甲醛固定過(guò)夜后，梯度脫水(25%，50%，100%，100%)于甲醇中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 斑馬魚整胚原位雜交

選取crestin，snail1b和foxd3基因靠近3’UTR區(qū)域的一段cDNA序列作為探針的模板。設(shè)計(jì)引物用于模板的擴(kuò)增，其中下游引物5’端有T7啟動(dòng)子序列，序列信息如表2所示。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)回收后可直接用于合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針。合成的探針用原位雜交液HYB+(50%甲酰胺，5 × SSC，0.1% Tween-20，0.5 mg/mL酵母RNA，0.05 mg/mL肝素)稀釋到1.5%使用。探針使用之前，需于72℃變性處理10 min。sox10探針的序列信息詳見(jiàn)已報(bào)道的文獻(xiàn)[20]。

雜交第1天，取大約30枚胚胎到無(wú)核酸酶的EP管中，用配制在DEPC水中的PBST溶液梯度水化，水化后置換成 1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min。然后用1 mL PBST溶液洗滌二次，每次5 min。吸走PBST溶液，加入300 μL 65℃預(yù)熱的HYB-(50%甲酰胺，5 × SSC，0.1% Tween-20)溶液，65℃放置5 min；再置換成300 μL HYB+溶液，65℃預(yù)雜交3～4 h。將探針稀釋，于72℃變性10 min后，立即置于冰上，用100 μL探針稀釋液置換HYB+溶液，65℃水浴雜交12～16 h。第2天吸出探針，-20℃保存并可重復(fù)使用。胚胎用洗液I(50%甲酰胺，2× SSC，0.1% Tween-20)65℃洗2次，每次30 min，之后置換成2× SSCT溶液于65℃洗滌胚胎15 min。然后依次用0.2× SSCT溶液和0.02× SSCT溶液洗滌胚胎4次，每個(gè)濃度兩次，每次30 min。然后置換成MABT溶液，室溫放置5 min，重復(fù)一次后，換成封閉液(滅活山羊血清、10%封閉劑和MABT按照1∶2∶7比例混合)，室溫孵育1 h。之后，置換成抗體孵育液(堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體按1∶3000的比例稀釋于封閉液中)，4℃孵育12～16 h。第3天，吸走抗體孵育液，加入含10%滅活山羊血清的MABT溶液，室溫?fù)u動(dòng)30 min；置換成MABT溶液，搖動(dòng)30 min，再重復(fù)2次，時(shí)間依次為1 h和30 min。之后置換成染色緩沖液(100 mmol/L氯化鈉，50 mmol/L氯化鎂，100 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L左旋咪唑和 0.1% Tween-20)，室溫放置 5 min，重復(fù)3次。然后將胚胎轉(zhuǎn)移至48孔板中，除去染色緩沖液，加入200 μL底物，用錫箔紙包裹后于室溫反應(yīng)。每30 min取出觀察顯色結(jié)果。待顯色充分后，吸走底物，用PBST溶液洗滌兩次，然后置換成4%多聚甲醛，4℃放置過(guò)夜以終止反應(yīng)。用PBST 溶液洗滌胚胎兩次后，置換成甘油，待胚胎完全浸潤(rùn)后在徠卡體式顯微鏡下進(jìn)行拍照。

表2 合成探針模板的引物名稱及序列Table 2 Primer names and sequences of the synthetic probe templates

2 結(jié)果

2.1 利用MO抑制smad2的表達(dá)

根據(jù)smad2的基因結(jié)構(gòu)，本研究設(shè)計(jì)了兩條針對(duì)性干擾smad2第4、5外顯子剪接的MO，分別命名為SM1和SM2。為了確定smad2 SM1和SM2是否可以干擾其正確剪接過(guò)程，從而下調(diào)smad2基因的表達(dá)，我們提取了未注射和不同注射組胚胎的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并通過(guò)不同位置的檢測(cè)引物對(duì)目的片段擴(kuò)增(引物位置如圖1A所示)。

核酸凝膠電泳顯示注射SM1和SM2后，smad2前體mRNA的剪接被破壞。其中，actin引物擴(kuò)增的目的條帶大小和亮度在各個(gè)樣品中一致，表明各樣品間總RNA的量一致；陽(yáng)性對(duì)照引物擴(kuò)增的條帶在各處理組間基本一致，表明smad2 mRNA的總量變化不大；與未注射組相比，在不同MO注射組中，MO引物擴(kuò)增的目的條帶相對(duì)較少，表明smad2第4和5號(hào)外顯子正確剪接的比率降低，其中SM1的效率高于SM2，并且SM1與SM2共注幾乎可以阻止smad2進(jìn)行正確剪接；在MO注射組中，SM1與SM2引物擴(kuò)增出非正確剪接的條帶，表明4號(hào)內(nèi)含子被保留下來(lái)，從而干擾正常smad2 mRNA的表達(dá)(如圖1B所示)。

注：A. smad2 SM1/2有效性驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)示意圖。青色引物和紫色引物分別用于檢測(cè)單獨(dú)注射SM1和SM2的有效性，綠色引物用于檢測(cè)SM1和SM2共同注射的有效性，藍(lán)色引物作為陽(yáng)性對(duì)照。紅色短線標(biāo)明SM1和SM2的結(jié)合位置。B. DNA電泳結(jié)果顯示SM1/2對(duì)smad2 mRNA剪接正確性的影響。箭頭表示目的條帶，三角箭頭表示新出現(xiàn)的剪接體。圖1 smad2 SM1和SM2有效性檢測(cè)Note. A. Schematic design of the smad2 SM1/2 primer validation. Cyan primers and purple primers were used to detect the effectiveness of SM1 and SM2 injection alone, green primers were used to detect the effectiveness of SM1 and SM2 injection together, and blue primers were used as positive control. The red short line indicated the combination position of SM1 and SM2. B. DNA electrophoresis results showed that SM1/2 affected the splicing accuracy of smad2 mRNA. The arrow represented the target band, and the triangular arrow showed the emerging splice.Figure 1 Validity detection of the smad2 SM1 and SM2

2.2 p53 MO不會(huì)影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育

由于注射MO可能會(huì)引起p53信號(hào)通路的激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等非特異性表型的出現(xiàn)[21]。并且之前的文獻(xiàn)表明與p53 MO共同注射可以挽救smad3 MO引起的凋亡表型[12]。為此，我們注射p53 MO至單細(xì)胞受精卵中，通過(guò)原位雜交檢測(cè)神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因snail1b，sox10，foxd3及crestin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與野生型胚胎相比，注射p53 MO的胚胎snail1b，sox10，foxd3和crestin的表達(dá)量均無(wú)明顯變化(圖2)，表明p53的敲低并不會(huì)影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育。因此，在接下來(lái)的研究中，為了避免非特異的調(diào)亡現(xiàn)象，我們注射smad2 MO以及smad3a/bMO的同時(shí)，均會(huì)與同濃度的p53 MO共注射。

注：6體節(jié)時(shí)期神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因的原位雜交結(jié)果(bar=200 μm)。(下圖同)圖2 p53 MO不會(huì)影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育Note. In situ hybridization of marker genes of neural crest cells at 6-somite stage (bar=200 μm). (The same in the following figures)Figure 2 p53 MO does not affect the development of neural crest cells

2.3 敲低smad2/3對(duì)不同神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因的影響

為了探究Smad2/3對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育的影響，我們分別將smad2 SM1、smad2 SM2、smad3aMO和smad3bMO注射到野生型斑馬魚單細(xì)胞期的受精卵中，待胚胎發(fā)育至6體節(jié)時(shí)通過(guò)原位雜交檢測(cè)神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因snail1b、sox10、foxd3和crestin的表達(dá)情況。原位雜交結(jié)果顯示，smad2/3a被敲低后，crestin的表達(dá)量顯著降低，snail1b、sox10和foxd3的表達(dá)量無(wú)明顯變化；smad3b被敲低后，snail1b、sox10、foxd3和crestin的表達(dá)量均無(wú)明顯變化(圖3)。crestin是斑馬魚中特異標(biāo)記所有神經(jīng)嵴細(xì)胞的標(biāo)志基因，其表達(dá)量的顯著降低預(yù)示smad2/3a敲低使得神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育異常。因此，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因crestin作為研究對(duì)象探究Smad2/3a對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育的影響。

圖3 敲低smad2/3a對(duì)不同神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因的影響Figure 3 Effect of smad2/3 knockdown on the expression of marker genes in different neural crest cells

2.4 敲低smad2/3a會(huì)特異抑制crestin表達(dá)

為了探究Smad2和Smad3a對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育的影響，我們分別將smad2 SM1/SM2和smad3aMO注射到野生型斑馬魚單細(xì)胞期的受精卵中，待胚胎發(fā)育至6體節(jié)時(shí)檢測(cè)crestin的表達(dá)情況。原位雜交結(jié)果表明smad2/3a敲低使crestin表達(dá)下降，與前面的結(jié)果保持一致(圖4)。為了進(jìn)一步確定Smad2和Smad3a對(duì)crestin的影響是否特異，本研究通過(guò)體外合成了casmad2 mRNA和smad3amRNA，分別在單細(xì)胞時(shí)期注入野生型胚胎，6體節(jié)時(shí)通過(guò)原位雜交檢測(cè)crestin的表達(dá)情況。caSmad2是持續(xù)激活形式的Smad2，該突變體不含有MH1結(jié)構(gòu)域，其位于羧基端的絲氨酸-甲硫氨酸-絲氨酸(SMS)基序被突變?yōu)樘於彼?甲硫氨酸-天冬氨酸(DMD)基序，以此來(lái)模擬Smad2被受體激活的磷酸化狀態(tài)。之前的研究表明在斑馬魚中，過(guò)表達(dá)全長(zhǎng)的smad2不會(huì)對(duì)胚胎造成任何影響，但過(guò)表達(dá)casmad2則導(dǎo)致嚴(yán)重的背部化和第二體軸的形成[17]，表明caSmad2是Smad2的持續(xù)激活形式，可以更有效的激活下游信號(hào)傳導(dǎo)。結(jié)果顯示，注射了casmad2 mRNA和smad3amRNA后，crestin的表達(dá)量升高(圖4)。敲低和過(guò)表達(dá)smad2/3a對(duì)crestin的表達(dá)產(chǎn)生相反的結(jié)果，由此我們推測(cè)Smad2/3a特異性地調(diào)控crestin的表達(dá)。

圖4 smad2/3a特異性地調(diào)控crestin的表達(dá)Figure 4 smad2/3a specifically regulates the expression of crestin

2.5 過(guò)表達(dá)casmad2和smad3a可拯救smad2/3a敲降所導(dǎo)致crestin的低表達(dá)

為了確定crestin的低表達(dá)是由smad2及smad3a基因敲降直接造成的，我們分別將smad2 SM1/SM2和casmad2 mRNA及smad3aMO和smad3amRNA共注射到野生型斑馬魚單細(xì)胞期的受精卵中。待胚胎發(fā)育到6體節(jié)時(shí)，通過(guò)原位雜交檢測(cè)crestin的表達(dá)是否被挽救。結(jié)果顯示，與單獨(dú)注射MO的胚胎相比，MO和mRNA共注射胚胎中crestin的表達(dá)量基本可以回歸到野生型胚胎的水平(圖5)，進(jìn)一步表明Smad2和Smad3a在神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中特異性地調(diào)控crestin的表達(dá)。

圖5 過(guò)表達(dá)casmad2和smad3a可拯救smad2/3a敲降所導(dǎo)致crestin的低表達(dá)Figure 5 Overexpression of casmad2 and smad3a rescues the down-regulation of crestin caused by smad2/3a MO injection

3 討論

神經(jīng)嵴起源于神經(jīng)板的邊界，其誘導(dǎo)發(fā)生、分化和遷移受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Snail，Sox9，Sox10，F(xiàn)oxd3等[16]。Foxd3在維持神經(jīng)嵴細(xì)胞祖細(xì)胞未分化狀態(tài)發(fā)揮了重要作用，foxd3突變體胚胎存在嚴(yán)重的顱面畸形、色素較少的表型，其缺失導(dǎo)致sox10，sox9b，snail1b和crestin的表達(dá)均下調(diào)[22]。Sox9b對(duì)顱骨神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移過(guò)程有影響，缺失sox9b導(dǎo)致胚胎僅有較少的軟骨細(xì)胞，而且sox9b的表達(dá)減少或增加都會(huì)影響sox10，snail1b，foxd3和crestin的正常表達(dá)[23]。Sox10在軀干和迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞分化遷移過(guò)程中有一定的作用，缺失sox10的突變體胚胎缺乏色素，神經(jīng)嵴細(xì)胞在遷移過(guò)程中凋亡[24]。Snail1b表達(dá)量的增加或減少導(dǎo)致神經(jīng)嵴區(qū)域增加或神經(jīng)嵴細(xì)胞分化遷移受阻，同時(shí)snail1b可直接調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程，進(jìn)而影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育[25]。本研究結(jié)果顯示敲低smad2/3a后，6體節(jié)時(shí)期胚胎中foxd3，snail1b和sox10的表達(dá)量變化并不明顯，可能是因?yàn)镾mad2/3a對(duì)于這些轉(zhuǎn)錄因子并沒(méi)有直接調(diào)控作用，或者是需要其他信號(hào)通路的協(xié)同作用，單一信號(hào)通路的抑制并不會(huì)使這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到明顯影響。而crestin有可能可以受到smad2/3a的直接調(diào)控。當(dāng)然，要更進(jìn)一步探究Smad2/3a對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育的影響，如對(duì)色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等形成的調(diào)控，我們需收集10～12體節(jié)甚至更晚時(shí)期smad2/3a敲低、甚至是相應(yīng)基因敲除的胚胎，檢測(cè)上述神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記基因及下游分化細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)，確定Smad2/3a在神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育中的功能。

smad2/3a的表達(dá)被敲低后，crestin的表達(dá)顯著降低，而且這種低表達(dá)可以被smad2/3a的過(guò)表達(dá)所挽救，意味著smad2/3a調(diào)控crestin的表達(dá)是特異地，為此我們通過(guò)生物信息學(xué)手段分析了crestin的啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)crestin啟動(dòng)子序列中存在著Smad2/3a的潛在結(jié)合區(qū)，說(shuō)明Smad2/3a可能通過(guò)與crestin啟動(dòng)子直接相互作用，從而調(diào)控crestin的表達(dá)，這種相互作用需要進(jìn)一步的ChIP實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。此外，之前的研究結(jié)果表明在crestin的啟動(dòng)子區(qū)域存在包含sox10在內(nèi)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，突變sox10結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因魚Tg(crestin:EGFP) 的綠色熒光表達(dá)顯著降低，說(shuō)明crestin受到sox10等多種神經(jīng)嵴轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[26]。經(jīng)過(guò)分析，我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)在crestin啟動(dòng)子區(qū)還存在Sox家族蛋白的潛在結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明Sox可能作為上游調(diào)控因子參與調(diào)控crestin的表達(dá)。在爪蟾中，Smad3與含有高遷移率(HMG)結(jié)構(gòu)域的淋巴增強(qiáng)劑結(jié)合因子1/T細(xì)胞特異性因子(LEF1/TCF)存在物理相互作用[27]，而Sox9是含有HMG域的轉(zhuǎn)錄因子，提示Smad3a可能與Sox9b存在相互作用，共同調(diào)控crestin的表達(dá)，但這需要通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

斑馬魚胚胎神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育受一系列信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中任何一因子功能的缺失都會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常。本研究首次證實(shí)Smad2/3a對(duì)神經(jīng)嵴細(xì)胞特異性標(biāo)記基因crestin的表達(dá)有調(diào)控作用，這為后續(xù)進(jìn)一步研究Smad2/3a或其介導(dǎo)的TGF-β信號(hào)通路在神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。