閆義濤 王曉麗 谷圓圓 任艷凡 胡俊喜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科，新鄉(xiāng)453003)

失明或視力障礙嚴重影響人類生活質量。視網膜血管新生是造成早產兒視網膜病變、糖尿病視網膜病變、老年性黃斑變性等各個年齡階段眼病致盲及視力障礙的主要原因[1,2]。大量研究揭示了抗血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)療法對視網膜疾病的療效[3]。但目前的抗VEGF藥物成本效益并不理想，且會產生眼部或全身性的副作用，如眼內炎、眼內出血和視網膜脫離、心肌梗死、中風等[4-6]。開發(fā)安全有效的眼病治療方法迫在眉睫。長期以來藏紅花因具有抗氧化，抗炎及免疫調節(jié)等生物活性而被作為多種疾病的治療藥物[7,8]。藏紅花素(化學結構式見圖1)是藏紅花的主要成分，是一種類胡蘿卜素衍生物，有利于神經系統(tǒng)疾病、心血管疾病及癌癥的治療[9-12]。據報道藏紅花素還具有保護缺血再灌注誘導的視網膜損傷功能[13]。但藏紅花素對視網膜細胞血管新生的作用還有待進一步研究。本文的主要目的是通過氯化鈷處理視網膜色素上皮(Retinal pigment epithelial,RPE)細胞建立缺氧模型，探索藏紅花素對缺氧誘導的RPE細胞血管新生的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPE細胞來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。培養(yǎng)基 DMEM及胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。藏紅花素和氯化鈷購自Sigma公司。MTT購自上海生工。血管生成載玻片購自德國Ibidi公司。Matrigel膠購自BD公司?？笻IF-1α抗體、鼠抗VEGF抗體、鼠抗鼠VEGR2抗體和兔抗P-P38抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物處理 RPE細胞在添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞增殖到約80%時進行傳代。RPE細胞分為5組：對照組(RPE)、缺氧組(CoCl2)、藏紅花素組(CoCl2+5、10、25 μmol/L藏紅花素)。缺氧組用200 mmol/L的CoCl2處理。藏紅花素組用200 mmol/L的CoCl2聯(lián)合5、10、25 μmol/L藏紅花素進行處理。對照組用DMSO處理。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖 按照上述分組對RPE細胞進行處理后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在各個檢測時間點加入MTT溶液孵育4 h，棄上清后加入DMSO振蕩10 min溶解結晶物。最后570 nm處檢測吸光值。

1.2.3 流式分選檢測血管內皮細胞標記物CD31和CD34水平 首先收集各組細胞并制成1×106個/ml的細胞懸液，然后分別加入鼠抗CD31或鼠抗CD34抗體孵育30 min，漂洗后加入異硫氰酸(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的鼠二抗孵育30 min。最后將經過染色標記的上述細胞放入流式細胞儀進行分析。

1.2.4 血管生成實驗 首先將Matrigel膠放入4℃冰箱過夜以便將其緩慢融化。第2天將融化的Matrigel膠加入血管生成載玻片中，放入培養(yǎng)箱中包被30 min。然后將各組細胞制成6×104個/ml的細胞懸液加入到血管生成載玻片中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。最后取出顯微鏡下拍照并統(tǒng)計微管長度和分支數(shù)。

圖1 藏紅花素化學結構式Fig.1 Chemical structure of crocin

1.2.5 蛋白印跡 首先用PBS將細胞清洗3次后，加入添加了蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行裂解提取總蛋白，100℃變性5 min。然后等量的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，接著5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育，最后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。接著加入發(fā)光液置于凝膠成像儀進行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05表示存在統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藏紅花素對RPE細胞活力的影響 不同濃度(0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)的藏紅花素處理RPE細胞后，利用MTT檢測細胞毒性。圖2 顯示，藏紅花素小于25 μmol/L時對RPE細胞無明顯毒性，細胞存活率大于80%。藏紅花素大于25 μmol/L后，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞存活率低于80%。選擇無毒性的3個濃度(5、10、25 μmol/L)的藏紅花素進行后續(xù)實驗。

2.2 藏紅花素可抑制缺氧誘導的RPE細胞增殖 通過MTT檢測藏紅花素對缺氧誘導的RPE細胞增殖能力的影響。如圖3所示，缺氧組RPE細胞增殖明顯高于對照組(P<0.05)。藏紅花素(10、25 μmol/L) 處理可明顯降低缺氧誘導的RPE細胞增殖的升高(P<0.05)。結果表明，藏紅花素(10、25 μmol/L)處理會抑制缺氧誘導的RPE細胞增殖。

圖2 藏紅花素對RPE細胞活力的影響Fig.2 Effect of crocin on cell viability of RPENote: *.P<0.05 vs 1 μmol/L.

2.3 藏紅花素會降低缺氧誘導的RPE細胞中血管內皮細胞標記物表達 為分析藏紅花素對缺氧誘導的RPE細胞中血管內皮細胞標記物的影響，利用流式分選技術檢測RPE細胞中CD31和CD34水平。由圖4可知，缺氧組CD31和CD34陽性細胞數(shù)目明顯多于對照組(P<0.05)。5 μmol/L的藏紅花素處理可降低缺氧誘導的RPE細胞中CD31陽性細胞數(shù)目的增多(P<0.05)。10、25 μmol/L藏紅花素會減少缺氧誘導的RPE細胞中CD31和CD34陽性細胞數(shù)目(P<0.05)。由此可見，藏紅花素可降低缺氧誘導的RPE細胞中CD31和CD34分泌。

圖3 MTT檢測細胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by MTTNote: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs hypoxia group.

2.4 藏紅花素可減弱缺氧誘導的RPE細胞血管新生 采用血管生成實驗檢測微管長度和分支數(shù)，探究藏紅花素對缺氧誘導的RPE細胞血管新生能力的影響。圖5顯示，缺氧會造成RPE細胞血管新生過程中微管長度變長和分支數(shù)變多(P<0.05)。10、25 μmol/L藏紅花素處理會抑制缺氧誘導的RPE細胞血管新生過程中微管長度和分支數(shù)(P<0.05)。以上結果說明，10、25 μmol/L藏紅花素可減弱缺氧誘導的RPE細胞血管新生能力。

2.5 藏紅花素對血管新生相關蛋白表達的影響 為分析藏紅花素影響缺氧誘導的RPE細胞血管新生的分子機制，蛋白印跡檢測血管新生相關蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38表達。由圖6可知，缺氧組HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)。與缺氧組相比，5 μmol/L的藏紅花素組VEGR2蛋白水平明顯降低；10、25 μmol/L藏紅花素組HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平則明顯下降(P<0.05)。由此可見，藏紅花素處理會抑制缺氧誘導的RPE細胞血管新生相關蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白表達水平。

圖4 流式分選檢測CD31和CD34水平Fig.4 Levels of CD31 and CD34 were tested by flow cytometerNote: *.P<0.01vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

圖5 Matrigel實驗檢測血管生成Fig.5 Angiogenesis was measured by Matrigel assayNote: *.P<0.01 vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

圖6 蛋白印跡檢測血管新生相關蛋白表達Fig.6 Expression of angiogenesis related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.01 vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

3 討論

據調查，2010年全世界有3 240萬人失明，19 100萬人患有中度或重度視力障礙[14]。由于人口老齡化的加劇，預計未來全球各種眼病負擔會不斷加大，且治療費用也將上升[15-17]。眼病治療是公共衛(wèi)生健康系統(tǒng)的重大課題。研究表明許多植物提取物在各種疾病方面發(fā)揮著重要作用[18,19]。

研究表明RPE細胞不受控的增殖會激發(fā)視網膜血管新生[20]。大量文獻報道多種植物提取物具有抑制細胞異常增殖的功能。有數(shù)據顯示草藥三果寶的主要活性物質訶子鞣質和柯黎勒酸可抑制TGFβ1誘導的視網膜色素上皮細胞ARPE-19增殖[21]。據報道白藜蘆醇可抑制缺氧誘導的視網膜血管內皮細胞RF/6A增殖的升高[22]。有研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有降低肺癌細胞A549 和SPC-A1增殖的功效[23]。有數(shù)據顯示藏紅花素可抑制白血病Jurkat細胞增殖[24]。Lu等[25]發(fā)現(xiàn)藏紅花素會減弱乳腺癌細胞MCF-7的增殖能力。本文結果表明，藏紅花素處理可降低缺氧誘導的RPE細胞增殖。

據報道內皮組細胞向血管內皮細胞分化的過程中CD31和CD34陽性細胞數(shù)目會增加，CD31和CD34常被用作血管內皮細胞標記物，衡量血管新生[26]。許多植物提取物在抑制各類疾病的血管內皮細胞標記物分泌方面發(fā)揮著積極作用。Zhou等[27]研究顯示金銀花提取物可降低糖尿病視網膜病變小鼠視網膜CD31的分泌。據報道富含番茄紅素的番茄提取物可抑制亞硝基二乙基胺誘導的肝癌小鼠CD31釋放[28]。有數(shù)據顯示圓柏提取物可降低肝癌腫瘤組織中CD31的水平[29]。有研究表明鼓槌石斛的乙醇提取物可減弱糖尿病大鼠視網膜CD31的分泌[30]。本文結果顯示，藏紅花素會抑制缺氧誘導的RPE細胞中CD31和CD34的分泌。

血管新生在各類疾病的進程中起著重要作用。大量研究表明多種植物提取物可抑制血管新生。Vavilala等[31]發(fā)現(xiàn)木蘭屬植物提取物秦皮乙素氧可降低缺氧誘導視網膜病變小鼠視網膜血管新生。有數(shù)據顯示野艾蒿提取物可減弱人臍靜脈內皮細胞管腔形成[32]。據報道川芎提取物的主要活性物質丁烯基酞內酯可抑制人臍靜脈內皮細胞的血管新生[33]。有研究表明蓮花葉提取物可降低乳腺癌細胞的血管新生能力[34]。Umigai等[35]發(fā)現(xiàn)藏紅花素可抑制VEGF誘導的視網膜內皮細胞血管新生。本研究結果顯示，藏紅花素具有減少缺氧誘導的RPE細胞血管新生過程中微管長度和分支數(shù)量的作用，可降低缺氧誘導的RPE細胞血管新生能力。

HIF-1α/VEGF通路的異?；罨且暰W膜新血管化的根本原因[31]。許多植物提取物可抑制HIF-1α/VEGF通路的激活。有研究發(fā)現(xiàn)紅球姜根莖提取物可降低糖尿病大鼠視網膜VEGF表達，抑制視網膜血管新生[36]。據報道和厚樸酚可降低缺氧誘導的視網膜色素上皮細胞HIF-1α和VEGF表達[37]。有數(shù)據顯示桑葉提取物可抑制糖尿病大鼠視網膜VEGF表達[38]。據報道藏紅花素可抑制致癌物二乙基亞硝胺誘導的肝組織VEGF表達[39]。有研究顯示藏紅花素會降低二嗪農誘導的大鼠心臟組織HIF-1α蛋白表達水平[40]。另外用藏紅花素預處理缺血再灌注大鼠可抑制HIF-1α表達的上升[41]。本文結果顯示，藏紅花素處理可抑制缺氧誘導的RPE細胞血管新生相關蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白表達水平。

簡而言之，在缺氧誘導的RPE細胞中，藏紅花素處理可降低細胞增殖，減少CD31和CD34分泌，減弱血管新生能力，降低HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平。綜上所述，藏紅花素可通過HIF-1α/VEGF通路抑制缺氧誘導的視網膜細胞血管新生。后續(xù)計劃將在體內探究藏紅花素對視網膜血管新生的影響，為挖掘新的眼病治療方法奠定基礎。