馬 群，汪彩莉，李曉環(huán)，程險(xiǎn)峰，汪棉坤

（湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋 434200）

大曲是釀酒生產(chǎn)的主要糖化發(fā)酵劑，素有“曲乃酒之骨”之稱。糖化力指的是大曲中具有糖化作用的微生物及酶將淀粉分解為葡萄糖的能力，是衡量大曲糖化作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)，是大曲最為重要的理化考核指標(biāo)之一。準(zhǔn)確分析大曲糖化力對(duì)指導(dǎo)釀造生產(chǎn)的意義重大。斐林試劑法測(cè)定糖化力滴定終點(diǎn)顏色變化明顯，易于分辨。白云邊酒是兼香型的典型代表，具有獨(dú)特的生產(chǎn)工藝。白云邊采取高溫曲、中溫曲分開制曲，結(jié)合使用的方式進(jìn)行。而高溫曲和中溫曲糖化力差別巨大，依靠傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很容易出現(xiàn)檢測(cè)誤差。所以本文針對(duì)這一特殊現(xiàn)象，在原有檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，探索更適合白云邊大曲糖化力的檢測(cè)方法，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

白云邊成品曲倉(cāng)庫(kù)隨機(jī)抽取儲(chǔ)存期達(dá)到3 個(gè)月以上的高溫大曲。

1.1.2 試劑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 g/L）：準(zhǔn)確稱取已烘干的無(wú)水葡萄糖1.0 g，用水溶解，加約5 mL 濃鹽酸（防腐），并用水溶至1000 mL。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH4.6）

2 mol/L醋酸溶液：量取118 mL冰醋酸，加水稀釋至1000 mL。

2 mol/L 醋酸鈉溶液：稱取272 g 醋酸鈉(CH3COONa·3H2O)，加水溶解，并用水稀釋至1000 mL。將以上兩種溶液等體積混合均勻。

淀粉溶液（20 g/L）：稱取20.00 g 預(yù)先以100～105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉，用水調(diào)成糊狀，不斷攪拌下注入800 mL 沸水，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后，在1000 mL 容量瓶中定容至刻度，搖勻，當(dāng)天配制使用，若使用量減小，可按比例減少配制量。

氫氧化鈉溶液C(NaOH)＝0.1 mol/L：稱取4 g 分析純氫氧化鈉，加少量蒸餾水溶解并稀釋至1000 mL，搖勻，貯存于聚乙烯瓶中（不必標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度）。

斐林試劑甲液：稱取15 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）、0.05 g次甲基藍(lán)，用水溶解并稀釋至1000 mL。

斐林試劑乙液：稱取50 g 酒石酸鉀鈉、54 g 氫氧化鈉、4 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.1.3 儀器設(shè)備

恒溫水浴鍋、250 mL 燒杯、50 mL 容量瓶、滴定管、三角瓶、電爐。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原糖化力檢測(cè)方法

固體曲浸出液的制備：按計(jì)算量，稱取相當(dāng)于5.00 g 絕干曲的試樣量，置于250 mL 燒杯中，加入90 mL 水及pH4.6 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液10 mL，攪勻。置燒杯于35 ℃恒溫水浴中保溫1 h，間隔15 min攪拌1 次。浸出液用脫脂棉或多層紗布過濾，濾液盡快測(cè)定。

糖化液的制備：吸取25.0 mL 的20 g/L 淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加pH4.6的緩沖溶液5 mL，將容量瓶置于35 ℃水浴中保溫10 min。加入5.00 mL固體曲浸出液，立即混勻計(jì)時(shí)。準(zhǔn)確于35 ℃下保溫1 h，迅速加入15 mL 的0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，終止酶解反應(yīng)。冷卻至室溫后，用水定容至50 mL，搖勻，得到糖化液。

空白對(duì)照：吸取25.0 mL 20 g/L淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加入pH4.6 的緩沖溶液5 mL。先加入15 mL 的0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，然后再準(zhǔn)確加入5.00 mL固體曲浸出液，用水定容至50 mL，搖勻。

測(cè)定：吸取斐林試劑甲液、乙液各5.0 mL 于150 mL 三角瓶中，加入5.0 mL 制備好的糖化液，自滴定管中加入一定量1.0 g/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(使隨后滴定時(shí)其用量不超過1 mL)，于電爐上加熱至沸騰，保持沸騰2 min，在沸騰狀態(tài)下繼續(xù)用1.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色剛好消失而呈淺黃色，記錄葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總用量。此滴定操作需在1 min內(nèi)完成。其消耗的1.0 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)控制在1 mL內(nèi)。同時(shí)作一空白試驗(yàn)。

空白試驗(yàn)：吸取斐林試劑甲液、乙液各5.0 mL于三角瓶中，加入5.0 mL 制備好的空白液，以下操作同試樣的測(cè)定。

計(jì)算：固體曲糖化力的定義：在35 ℃，pH4.6時(shí)，1 g 絕干曲1 h 內(nèi)酶解可溶性淀粉為葡萄糖的量。

式中：X——糖化力，葡萄糖mg/g·h；

V0——空白試驗(yàn)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，mL；

V——試樣測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，mL；

ρ——葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，g/mL；

m——以絕干曲計(jì)的試樣稱取量（5.00 g）；

t——酶解時(shí)間，h。

1.2.2 傳統(tǒng)檢測(cè)方法的弊端分析

斐林試劑法測(cè)大曲糖化力，滴定終點(diǎn)顏色變化明顯，易于分辨。由于生產(chǎn)工藝的不同，高溫大曲和中溫大曲的糖化力差別較大，白云邊公司高溫曲糖化力的標(biāo)準(zhǔn)是100～300 mg/g·h，中溫曲糖化力的標(biāo)準(zhǔn)是≥500 mg/g·h。然而對(duì)于計(jì)算公式：

如果斐林試劑甲液、乙液按5 mL 來(lái)計(jì)算，V0值一般小于10.0 mL。將公式中ρ 為0.1 % g/ mL，m為5.00 g，t 為1 h。分別代入公式計(jì)算得出X=（V0-V）×40，也就是說(shuō)糖化力的最大測(cè)定值為400 mg/g·h，即在V 值為0 時(shí)測(cè)得，V 值為0 的試驗(yàn)現(xiàn)象就是在測(cè)定時(shí)加入測(cè)試的糖化液后，不需要再加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定，溶液直接變?yōu)闇\黃色，到達(dá)滴定終點(diǎn)。這種試驗(yàn)現(xiàn)象表明，樣品中加入的糖化液足夠?qū)? mL斐林試劑甲液、乙液氧化，不需要再滴定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。也就是說(shuō)在糖化力大于400 mg/g·h 時(shí)無(wú)法測(cè)得準(zhǔn)確結(jié)果，即測(cè)定高溫曲的糖化力采用此方法是適用的，但是中溫曲的糖化力一般大于500 mg/g·h，用此方法則測(cè)定不出準(zhǔn)確結(jié)果。

1.2.3 檢測(cè)方法的優(yōu)化

1.2.3.1 加大斐林試劑甲液、乙液的用量

在其他測(cè)試液用量不變的條件下，加大斐林試劑甲液、乙液的用量，將原檢測(cè)方法中的5 mL 增加為10 mL，代入計(jì)算公式后V0則增大為以前的2倍，此時(shí)的V0≤20.0 mL，代入計(jì)算公式X=（V0-V）×40，在V 值為0 時(shí)，X 的最大測(cè)定值為800 mg/g·h。當(dāng)中溫曲的糖化力小于800 mg/g·h時(shí)，用這種方法可以測(cè)定出準(zhǔn)確結(jié)果。

1.2.3.2 減少試液用量

斐林試劑甲液、乙液用量不變，在1.2.1 中的糖化過程中，固體曲浸出液的吸取量由原先的5.0 mL減少為2.0 mL；在1.2.1 的測(cè)定過程中，糖化液的加入量也由原先的5.0 mL 減少為2.0 mL。此時(shí)原來(lái)的公式中的系數(shù)也有相應(yīng)改變：

將公式中ρ 為0.1%g/mL，m 為5.00 g，t 為1 h。分別代入公式計(jì)算得出X=（V0-V）×250，計(jì)算公式中的系數(shù)由原來(lái)的40 增大至250，在V0≤10.0 時(shí)，X的最大測(cè)定值為2500 mg/g·h。最大測(cè)定值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于白云邊公司中溫曲的糖化力。所以減少試液用量的方法測(cè)定中溫曲糖化力是可行的。

2 結(jié)果與分析

2.1 比較兩種優(yōu)化后的試驗(yàn)方法

為了比較兩種方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，我們?nèi)×送粋€(gè)中溫曲樣品，分別用兩種試驗(yàn)方法測(cè)定，每種方法都測(cè)定了7 組數(shù)據(jù)。為了便于統(tǒng)計(jì)，我們把增大斐林試劑甲液、乙液用量的方法稱為方法一，減少試液用量的方法稱為方法二。兩種測(cè)定方法測(cè)得的糖化力結(jié)果見表1。

表1 中溫曲糖化力測(cè)定結(jié)果對(duì)照表 (mg/g·h)

2.2 準(zhǔn)確度的比較

準(zhǔn)確度是指測(cè)量值與真實(shí)值之間相符合的程度。準(zhǔn)確度的高低常以誤差的大小來(lái)衡量。即誤差越小，準(zhǔn)確度越高；誤差越大，準(zhǔn)確度越低。由于樣本的真實(shí)值是不可知的，在日常分析工作中，總是對(duì)某試樣平行測(cè)定，取其算術(shù)平均值作為真實(shí)值。從表1 可知，用方法一測(cè)得樣品糖化力的平均值為680 mg/g·h，可以作為方法一測(cè)得的真實(shí)值用于計(jì)算該組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差；用方法二測(cè)得樣品糖化力的平均值為675 mg/g·h，可以作為方法二測(cè)得的真實(shí)值用于計(jì)算該組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差。相對(duì)誤差是指誤差在真實(shí)值中所占的百分率。相對(duì)誤差的表示方法是：

圖1 糖化力測(cè)定值相對(duì)誤差對(duì)比圖

由圖1 可以看出，用方法二測(cè)定的一組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差值明顯要比用方法一測(cè)定的大，即方法一測(cè)定糖化力大小的準(zhǔn)確度要顯著高于方法二。

2.3 精密度的比較

精密度是指在相同條件下n 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果彼此相符合的程度。精密度的大小用偏差表示，偏差愈小說(shuō)明精密度愈高。絕對(duì)偏差表示單個(gè)樣本的精密度，用測(cè)定值減平均值來(lái)表示。

在數(shù)理統(tǒng)計(jì)中，一般測(cè)定次數(shù)有限，常用樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示精密度，其數(shù)學(xué)表達(dá)式（貝塞爾公式）為：

上式中xi為單個(gè)樣本值，為樣本平均值。（n-1）在統(tǒng)計(jì)學(xué)中稱為自由度，即在n 次測(cè)量中，只有（n-1）個(gè)獨(dú)立可變的偏差，因?yàn)閚 個(gè)絕對(duì)偏差之和等于0，所以只要知道（n-1）個(gè)絕對(duì)偏差，就可以確定第n個(gè)的偏差值。

表2 糖化力測(cè)定值絕對(duì)偏差對(duì)照表

方法一和方法二兩種測(cè)量結(jié)果，每次測(cè)量值的絕對(duì)偏差見表2。

通過表2 的絕對(duì)偏差值（xi）代入貝賽爾公式計(jì)算樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）分別為：

比較樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差S1和S2可以說(shuō)明第1 組數(shù)據(jù)的精密度高。因?yàn)榈? 組數(shù)據(jù)較集中且接近標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。由此可見，欲使準(zhǔn)確度高，首先必須要求精密度也要高，但精密度高并不說(shuō)明準(zhǔn)確度也高，因?yàn)榭赡茉跍y(cè)定中存在系統(tǒng)誤差，但精密度是保證準(zhǔn)確度的先決條件。

3 結(jié)論

應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法我們比較了兩種方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)論是方法一測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度都高于方法二。因?yàn)樵跍y(cè)定過程中定糖時(shí)濾液吸取量和斐林試劑甲液、乙液的用量改變了，這種改變使糖化力含量計(jì)算公式后面的系數(shù)發(fā)生變化。

滴定管的最小刻度是0.1 mL，即在滴定終點(diǎn)時(shí)，葡萄糖用量相差0.1 mL，用方法一就會(huì)帶入4 mg/g·h的絕對(duì)誤差，而方法二則代入25 mg/g·h 的絕對(duì)誤差。而滴定管在到達(dá)滴定終點(diǎn)時(shí)，由于滴定操作的差異，容易造成±0.1 mL～±0.3 mL 的滴定誤差。這就給測(cè)得的結(jié)果帶來(lái)相應(yīng)誤差，方法一會(huì)帶入±4 mg/g·h～±12 mg/g·h 的相對(duì)誤差，方法二則是±25 mg/g·h～±75 mg/g·h 的相對(duì)誤差。也就是說(shuō)，定糖操作時(shí)用方法一可以盡最大可能地減少由于人為操作引起的滴定誤差。

在日常的化驗(yàn)工作中我們應(yīng)該針對(duì)具體問題具體分析，白云邊高溫曲直接用原實(shí)驗(yàn)方法就能很準(zhǔn)確的測(cè)定出糖化力。基于準(zhǔn)確度和精密度考慮，測(cè)定白云邊中溫曲糖化力時(shí)我們宜選用優(yōu)化方案一，若糖化力高于800 mg/g·h，用方案一無(wú)法測(cè)定準(zhǔn)確結(jié)果時(shí)，則改為方案二。