徐岳鑫，張雪峰，胡生俊

宿遷市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇宿遷 223800

鐵莧菜為大戟科植物鐵莧菜Acalypha australis L.的干燥地上部分，在我國除西部高原或干燥地區(qū)外，其余各省區(qū)均有產(chǎn)生，長(zhǎng)于平原或山坡較濕潤(rùn)地方和空曠草地[1]。鐵莧菜飲片收載于《江蘇省中藥飲片炮制規(guī)范》2002年版[2]，其性涼味苦、澀，歸心、肺、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱、解毒、利濕、收斂、止血的功效，用于腸炎、痢疾、吐血、衄血、便血、崩漏；外治癰癤瘡瘍、皮炎濕疹。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，僅有性狀介紹，無法有效控制飲片的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鐵莧菜飲片的性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和含量測(cè)定等進(jìn)行研究，為該飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器和藥品、試劑

1260高效液相色譜儀 （美國Agilent公司）；BX51光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus公司）；AUW120D電子天平 （日本島津公司）；ATS4全自動(dòng)點(diǎn)樣儀及攝像裝置（瑞士Camag公司）；FED115D烘箱（德國Binder公司）；P330馬弗爐（德國Nabertherm公司）。

沒食子酸對(duì)照品 （純度90.8%，批號(hào)110831-201605）、鐵莧菜對(duì)照品（批號(hào) 121655-201502），均由中國食品藥品檢定研究院提供；試劑為分析純；水為純化水。

收集鐵莧菜樣品共8批，經(jīng)江蘇省中科院植物研究所徐增萊教授鑒定為大戟科植物鐵莧菜Acalypha australis L.的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀

為不規(guī)則的短段，莖、葉、花、果、種子混合。莖類圓形，切面黃白色，有髓，表面棕色，有縱條紋；葉多皺縮，破碎，黃綠色；花序腋生，苞片三角狀腎形，合時(shí)如蚌；蒴果小，三角狀扁圓形，種子黑色。氣微，味淡。

2.2 顯微特征

粉末黃綠色。葉上表皮細(xì)胞垂周壁略平整，下表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲，氣孔平軸式。非腺毛長(zhǎng)80～200μm，由 3～4（5）個(gè)細(xì)胞組成。草酸鈣蔟晶散在，直徑 26～56μm。顯微圖片見圖 1。

圖1 鐵莧菜顯微特征圖

2.3 薄層色譜鑒別

取本品粉末1g，加甲醇20mL，超聲提取20min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取鐵莧菜對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)[3]。吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm處檢視。在供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 鐵莧菜薄層色譜圖

2.4 水分測(cè)定

8批樣品水分的平均值為11.35%，以平均值的120%設(shè)限，為13.62%，暫規(guī)定本品水分不得超過14.0%。

2.5 灰分測(cè)定

8批樣品灰分的平均值為11.39%，以平均值的120%設(shè)限，為13.67%，暫規(guī)定本品總灰分不得超過14.0%。酸不溶性灰分的平均值為3.53%，以平均值的120%設(shè)限，為4.24%，暫規(guī)定本品酸不溶性灰分不得超過5.0%。

2.6 浸出物測(cè)定

8批樣品浸出物（熱浸法，以50%乙醇為溶劑）的平均值為21.05%，以平均值的80%設(shè)限，為16.84%，故暫規(guī)定本品醇溶性浸出物不得少于16.0%。

2.7 沒食子酸含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫TC-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇為 A，0.1%磷酸溶液為B （0～5min，A 為 10%，B 為 90%，5～20min，A 為10%→90%，B 為 90%→10%）； 流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm；進(jìn)樣量：5μL。

2.7.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品10mg，置50mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。

2.7.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末0.5g置圓底燒瓶中，加入4mol·L-1鹽酸50mL，稱定重量，加熱回流 4h，放冷，再稱定重量，用 4mol·L-1鹽酸補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.7.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，配成沒食子酸濃度分別為4.11、20.55、41.10、61.65、102.75、205.50 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5μL，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：Y=14.224X+3.755 2，r=0.999 6。結(jié)果表明，沒食子酸對(duì)照品濃度在 4.11～205.50μg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.7.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.7.4”項(xiàng)下濃度為61.65μg·mL-1的對(duì)照品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.3%，表明精密度良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別于 0、3、6、12、24 h 進(jìn)樣 5 μL，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，峰面積的RSD為0.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.7.3”供試品溶液制備方法平行制備6份，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算沒食子酸的含量的RSD為1.6%，表明重復(fù)性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的鐵莧菜樣品6份，每份0.25 g，按低、中、高濃度分別精密加入沒食子酸對(duì)照品約 2.4、3.0、3.6mg，照“2.7.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為97.22%，RSD為1.91%。

2.7.9 樣品測(cè)定 按“2.7.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)8批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果按干燥品計(jì)算，沒食子酸含量分別為1.23%、1.04%、0.33%、0.91%、1.03%、0.95%、1.96%、1.37%，平均值為1.10%，以平均值的80%設(shè)限為0.88%，故暫規(guī)定鐵莧菜中所含鞣質(zhì)以沒食子酸計(jì)不得少于0.80%。HPLC法圖譜見圖3、圖4。

圖3 沒食子酸對(duì)照品色譜圖

圖4 鐵莧菜飲片色譜圖

3 討 論

3.1 薄層色譜鑒別

在本實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)不同取樣量（0.5 g、1 g）和不同提取方式（冷浸過夜、超聲處理30min、水浴加熱回流30min）分別進(jìn)行了考察，確立了最佳樣品前處理方法。經(jīng)考察，供試品溶液在24h內(nèi)點(diǎn)樣，色譜圖中斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好。另對(duì)不同薄層板（默克產(chǎn)硅膠G預(yù)制薄層板、自制硅膠G薄層板）、不同展開系統(tǒng)[三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（5∶5∶1）、正己烷-乙酸乙酯（2∶1）、石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙醚（9∶1）]開展實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，本方法的薄層色譜斑點(diǎn)顯色穩(wěn)定、清晰一致。本實(shí)驗(yàn)還針對(duì)不同點(diǎn)樣量（2μL、5μL、10μL）和不同溫、濕度（t：5℃，RH：49%；t：19℃，RH：72%；t：19 ℃，RH：18%；t：19 ℃，RH：50%）等薄層條件進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，本薄層色譜耐受性好，能得到滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.2 浸出物測(cè)定

分別采用不同浸出方法（熱浸法、冷浸法）、不同溶劑（水、50%乙醇、95%乙醇）進(jìn)行比較，結(jié)果表明，以水和50%乙醇作溶劑，采用熱浸法浸出物較高；但樣品經(jīng)水提取后，過濾速度太慢，較為耗時(shí)，不利于實(shí)驗(yàn)操作。因此，確定以50%乙醇為溶劑，采用熱浸法來測(cè)定本品的浸出物含量。

3.3 含量測(cè)定

在設(shè)計(jì)含量測(cè)定方案時(shí)，考慮到鐵莧菜具有清熱解毒、收斂止血的功效，主要含有鞣質(zhì)、黃酮類、有機(jī)酸類化合物[4，5]。其中有機(jī)酸類為其清熱解毒功效的藥理學(xué)基礎(chǔ)，故也開展了咖啡酸、綠原酸和原兒茶酸等有機(jī)酸的含量測(cè)定，結(jié)果含量較低，故未選擇有機(jī)酸類進(jìn)行測(cè)定。鞣質(zhì)是鐵莧菜收斂止血作用的主要活性成分[6]。鞣質(zhì)具收斂性，內(nèi)服可用于治療胃腸道出血、潰瘍和水瀉等癥；外用于創(chuàng)傷、灼傷，可使創(chuàng)傷后滲出物中蛋白質(zhì)凝固，形成痂膜，可減少分泌和防止感染，能使創(chuàng)面的微血管收縮，有局部止血作用。Park WY等[7]發(fā)現(xiàn)，鐵莧菜中所含的鞣質(zhì)類型為沒食子酸型鞣質(zhì)，而沒食子酸作為該鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物，具有止瀉止血的藥理作用[8]。同時(shí)參考 《中國藥典》2015年版一部中收載的地榆、五倍子、委陵菜等具有收斂止血功效的飲片，均采用酸水解法測(cè)定所含鞣質(zhì)水解后的沒食子酸的含量，故本實(shí)驗(yàn)借鑒此思路，來測(cè)定鐵莧菜樣品中沒食子酸的含量。在有的文獻(xiàn)中[9]，采用甲醇超聲提取法直接測(cè)定其中沒食子酸含量，本實(shí)驗(yàn)也用該方法對(duì)8個(gè)樣品進(jìn)行提取、測(cè)定，結(jié)果表明，沒食子酸含量極低，僅為0.01%～0.06%，說明鐵莧菜中游離態(tài)的沒食子酸含量極低，故選擇了酸水解的方法測(cè)定鐵莧菜中沒食子酸的含量。