葛玉松

鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇鹽城 224000

丁細牙痛膠囊處方由丁香葉和細辛組成，具有清熱解毒、疏風止痛功能；用于治療風火牙疼，急性牙髓炎、急性根尖炎等癥[1]。本方中丁香葉中所含原兒茶酸、原兒茶醛具有廣譜抗菌消炎作用[2]；細辛所含細辛脂素具有祛風止痛功效，可用于治療牙痛[3]。因此可將細辛脂素、原兒茶酸、原兒茶醛作為本品含量測定指標。現(xiàn)行質(zhì)量標準[4]采用供試品在酸性條件下與亞硝鈉-鉬酸鈉反應，以原兒茶酸為對照，紫外分光光度法測定丁香葉內(nèi)的含量，此方法靈敏度及專屬性較差。本研究參照有關文獻[5-7]，采用高效液相色譜法同時測定丁細牙痛膠囊中細辛脂素、原兒茶醛、原兒茶酸的含量，以期更好地控制該品的質(zhì)量。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀 （島津企業(yè)管理中國有限公司）；XS205DU電子天平 （梅特勒-特利多電子有限公司）；XP26電子天平 （瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500型超聲波清洗器 （江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丁細牙痛膠囊 （規(guī)格0.45 g，批號20170903、20180312、20180907，深圳市泰康制藥有限公司）；細辛脂素對照品 （純度100.0%，批號111889-201504）、原兒茶酸 （純度99.9%，批號110809-201205）、原兒茶醛 （純度99.3%，批號110810-201608），均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；去離子水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak MG Ⅱ C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：乙腈-1%冰醋酸溶液；檢測波長：287nm；柱溫：35℃；流速：1mL·min-1；進樣量：10μL。流動相按表1進行梯度洗脫。

表1 乙腈-1%冰醋酸溶液梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取細辛脂素對照品15.25mg、原兒茶酸對照品20.90mg、原兒茶醛對照品10.59mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。精密量取1mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10粒內(nèi)容物，混合均勻，精密稱取0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲處理45min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 專屬性試驗 按“2.2.2”節(jié)方法的用量比例分別配制陰性對照溶液、除丁香葉陰性對照溶液、除細辛陰性對照溶液。分別取對照品混合溶液、供試品溶液、陰性對照溶液、除丁香葉陰性對照溶液及除細辛陰性對照溶液，照“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果表明，主成分峰分離度良好，主成分與雜質(zhì)能得到很好分離，原輔料均無干擾。見圖1。

圖1 專屬性試驗液相色譜圖

2.2.4 線性范圍考察 精密吸取對照品貯備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 置 10mL 量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取5μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。細辛脂素的回歸方程：Y=1.27×106X+789.25（r=0.999 9）；原兒茶酸的回歸方程：Y=8.25×105X-214.23 （r=0.999 9）； 原兒茶醛的回歸方程：Y=1.84×106X-42.99（r=0.999 9）。

結(jié)果表明，細辛脂素在0.015 25～0.152 5mg·mL-1、原兒茶酸在 0.020 88～0.208 8mg·mL-1、原兒茶醛在0.010 52～0.1052mg·mL-1的范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 進樣精密度試驗 取同一批號（20170903）供試品溶液重復進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果細辛脂素峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.46%，原兒茶酸峰面積RSD為0.47%，原兒茶醛峰面積RSD為0.51%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液 10μL， 分別在 0、2、4、8、12、24h 各進樣一次，測定峰面積，細辛脂素、原兒茶酸、原兒茶醛的RSD分別為1.36%、1.13%、1.18%。

2.2.7 重復性試驗 取同一批號（20170903）供試品，按“2.2.2”項下的方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果細辛脂素平均含量為2.74mg/粒，RSD為1.67%；原兒茶酸平均含量為4.71mg/粒，RSD為1.59%；原兒茶醛平均含量為2.56mg/粒，RSD 為1.43%。

2.2.8 加樣回收率試驗 取同一批己知含量供試品（平均裝量 0.4551 g，批號 20170903）6 份，每份約0.3 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密加入一定量的3種成分的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別測定細辛脂素、原兒茶酸、原兒茶醛的含量，并計算回收率，結(jié)果見表2。

2.2.9 樣品測定 取3批次樣品，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，分別測定含量，并按現(xiàn)行標準[4]采用紫外分光光度法測定原兒茶酸的含量，以作比較，結(jié)果見表3。

3 討 論

實驗中對對照品混合溶液進行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)細辛酯素最大吸收波長為287 nm，原兒茶醛最大吸收波長為313nm、278nm，原兒茶酸最大吸收波長為294 nm、259nm；根據(jù)樣品中3個主成分的含量、峰面積及其他物質(zhì)的影響，選擇檢測波長為287 nm。

實驗中參考《中國藥典》細辛項下細辛脂素[4]的含量測定方法，采用乙腈-水作為流動相，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸和原兒茶醛峰形嚴重拖尾。而采用乙腈-1%冰醋酸作為流動相，峰形較好，理論板數(shù)也較高，陰性無干擾。因原兒茶醛和細辛脂素保留時間相距較大，且兩個對照品峰間雜質(zhì)較少，減少試驗時間，并獲得較好的分離效果，因此流動相采用梯度洗脫法。

表2 加樣回收率結(jié)果（n=6）

表3 樣品測定結(jié)果（n=2）

在前處理的過程中，分別用甲醇、70%乙醇和甲醇-1%冰醋酸（70∶30）處理樣品，結(jié)果甲醇處理后得到的樣品雜質(zhì)最少，有效成分也提取完全。

將本研究方法測得的原兒茶酸含量與原標準含量比較，發(fā)現(xiàn)本法原兒茶酸含量明顯低于原標準，而RSD明顯好于原標準，這是因為紫外分光光度法專屬性較差，操作繁瑣，誤差較大，并不能真實反映供試品中原兒茶酸的含量。