鄧 瓊， 朱婉蓉， 王 鑄， 張建文， 梁 輝

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518109)

大腦皮層接收外界刺激后，刺激下丘腦分泌促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)進入垂體門靜脈循環(huán)，與垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)細胞內的受體(CRHR)結合，促進細胞合成和分泌ACTH。ACTH可以刺激腎上腺皮質釋放糖皮質激素。當糖皮質激素濃度升高至一定水平時，可以反饋作用于下丘腦和垂體，分別抑制CRH和ACTH的分泌，最后抑制糖皮質激素的分泌。因此，糖皮質激素的分泌就呈脈沖式分泌，約一小時一個周期，亦稱為超日節(jié)律[1]。

有研究提出，糖皮質激素抑制垂體ACTH的分泌介導糖皮質激素分泌超日節(jié)律的形成，垂體是調控糖皮質激素分泌的中樞[2]。在我們的前期研究中，我們建立了大鼠垂體細胞灌注系統(tǒng)，持續(xù)灌注CRH和血管升壓素，細胞的ACTH分泌亦呈脈沖式[3]。同時，應用大鼠垂體細胞灌注系統(tǒng)，我們研究發(fā)現(xiàn)，生理水平的糖皮質激素(10nM)可快速抑制垂體ACTH的分泌，不受轉錄抑制劑或蛋白翻譯抑制劑阻斷，且該抑制作用由糖皮質激素受體(GR)介導[4]。

有研究報道Pyk2(Proline-rich tyrosine kinase 2)磷酸化信號通路可能介導糖皮質激素在下丘腦神經(jīng)元的快速反應[5]。Pyk2，屬粘著斑激酶家族，廣泛分布于多種組織和細胞。Yang等發(fā)現(xiàn)皮質酮能激活酪氨酸激酶Pyk2，刺激10min后顯著提高402位點的磷酸化水平，并持續(xù)升高達60min或更長[5]?？沽姿峄疨yk2 Tyr-402的免疫染色也佐證了此實驗結果。Pyk2磷酸化能進一步激活位于其信號通路下游的蛋白激酶Src，Src激酶與GR形成穩(wěn)定的蛋白復合體。有研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能快速誘導Pyk2 Tyr-402的磷酸化[6,7]，在10min時達最高水平，而30min時降低至正常水平[6]。然而，Giles等人發(fā)現(xiàn)與對照組相比，地塞米松處理的巨噬細胞的Pyk2磷酸化水平要更低一些[8]。糖皮質激素激活Pyk2的具體機制仍有待進一步研究。

在本研究中，我們設計實驗，應用大鼠垂體細胞灌注系統(tǒng)，研究Pyk2磷酸化是否通過GR，參與介導糖皮質激素反饋。該研究將進一步闡明糖皮質激素作用的分子機制，豐富糖皮質激素生理作用的內涵，為臨床皮質醇增多癥的診治提供參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實驗動物及試劑

雄性SD(Sprague Dawley)大鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(中國佛山),ACTH濃度測定試劑盒來源于R&D systems(USA),細胞培養(yǎng)的試劑購自Gibco(Life Technologies，USA)，垂體細胞的原代分離試劑來源于Sigma Aldrich(USA),小鼠垂體瘤細胞系AtT20細胞購自ATCC(CRL-1795)。

1.2 垂體細胞的分離培養(yǎng)及灌注

大鼠體重225-250g，自由采食，到達后16h白天/8h黑夜的條件下穩(wěn)定飼養(yǎng)5天以上。CO2麻醉昏迷，斷頸處死。取垂體前葉組織，PBS清洗兩次，剪成1mm3的小塊，胰蛋白酶37℃消化15min，加DNaseI沉降組織，胰蛋白酶抑制劑終止消化，以2mM和1mM EDTA溶液洗滌兩次，將組織轉移至15ml的離心管內，輕輕反復吹打，吸取云狀上清到細胞篩過濾，反復重復此步驟。200g離心15min收集細胞，重懸后計數(shù)。將細胞稀釋至1.5×106個/ml，加Cytodex珠子(GE Healthcare)。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每30min輕微搖勻混合，待大部分細胞粘附珠子后，加入10%馬血清及雙抗。37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)48-72h。連接細胞灌注系統(tǒng)裝置，將垂體細胞轉移至細胞灌注系統(tǒng)中，37℃預熱的培養(yǎng)液(無血清培養(yǎng)基，0.1%BSA)預跑排盡裝置內空氣。細胞在系統(tǒng)中平衡6h，在開始刺激前，收集30min的培養(yǎng)液作為基礎水平參照，每5min收集的培養(yǎng)液作為一個樣品。將培養(yǎng)液轉換成含激素(CRH和皮質酮)的培養(yǎng)液，收集樣品，記錄添加的時間和對應的收集管號。實驗結束后，清洗整個系統(tǒng)，灌入空氣干燥。采用ACTH化學發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定樣品中ACTH的濃度。

1.3 蛋白免疫印跡

我們采用Pierce的培養(yǎng)細胞亞細胞蛋白分離試劑盒(Thermo Scientific，美國)，根據(jù)說明書提取蛋白后，測定蛋白濃度，按20μg蛋白/孔準備樣品，98℃水浴5min。上樣電泳，120V，1h 45min。轉膜，恒電流330mA 90min。5%TBST牛奶室溫封閉1h。一抗4℃孵育過夜；所用的抗體及其稀釋倍數(shù)見表1。次日TBST洗滌3次，每次5min；加入對應二抗常溫孵育1h。TBST洗滌3次，每次10min。用Millipore化學發(fā)光液發(fā)光，Tanon-5520自動曝光儀器化學曝光。

表1 實驗所用抗體

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以多個重復實驗的平均值±標準誤差表示，不同組之間的數(shù)據(jù)差異性檢驗是通過獨立樣本t檢驗或者One/Two-way ANOVA分析，后以Fisher配對檢驗。顯著性差異P<0.05。

2 結 果

2.1 皮質酮和CRH對Pyk2磷酸化的作用

我們培養(yǎng)小鼠垂體瘤細胞系AtT20細胞，并對細胞進行皮質酮和CRH刺激。我們之前的數(shù)據(jù)表明，30pM的CRH能促使垂體細胞穩(wěn)定地分泌ACTH，且10nM的皮質酮可以顯著抑制ACTH的分泌[3]。蛋白免疫印跡結果顯示，30pM的CRH刺激AtT20細胞，10min后Pyk2(Tyr402)磷酸化水平顯著上升(1.82±0.06倍，P<0.01)，隨后慢慢回落；同樣，單獨使用皮質酮刺細胞10min，Pyk2磷酸化水平升高1.58±0.10倍(P<0.05)，隨后回復接近正常水平。同時采用CRH和皮質酮處理細胞時，10min后Pyk2磷酸化水平略有下降(P>0.05)，20min后開始持續(xù)上升(2.33±0.35倍，P<0.01)。

2.2 Pyk2抑制劑PF對GR轉運的影響

我們檢測Pyk2抑制劑PF對GR轉運的作用。經(jīng)查閱資料和前期預實驗結果表明，3μM的PF能顯著抑制Pyk2磷酸化。細胞密度達70%-80%時,激素剝離血清過夜,次日無血清培養(yǎng)4h,加PF繼續(xù)培養(yǎng)2h,隨后以皮質酮刺激。蛋白免疫印跡(圖2A)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(圖2B)結果顯示，PF能顯著抑制GR向細胞核轉運，但不影響GR向細胞膜的轉運。

2.3 Pyk2抑制劑對糖皮質激素快速反饋的影響

垂體細胞在灌注系統(tǒng)中平衡6h，收取6個樣本(30min)作為基礎對照組；接著以30pM CRH刺激細胞1h，在處理組加入PF，10min后兩組均加入皮質酮；皮質酮刺激30min后撤掉PF和皮質酮，換30pM CRH繼續(xù)灌注1h。3次重復的實驗結果均顯示，PF不阻止皮質酮對CRH刺激ACTH分泌的快速抑制作用，PF引起了滯后的長時間的ACTH分泌的抑制(50-60min)。

A.蛋白質免疫印跡檢測結果；B.3個重復實驗的統(tǒng)計分析結果

圖1 皮質酮和CRH對Pyk2磷酸化的作用

Fig.1 Effect of corticosterone and CRH on Pyk2 phosphorylation

A.Dection of western blot;

B.Statistical data from three repeated experiments

A.蛋白質免疫印跡檢測結果；B.3個重復實驗的統(tǒng)計分析結果

圖2 PF對GR轉運的影響

Fig.2 Effect of PF on GR trafficking

A.Dection of western blot;

B.Statistical data from three repeated experiments(**:p<0.01)

圖3 PF對皮質酮抑制ACTH分泌的作用Fig.3 Effect of PF on corticosterone-inhibited ACTH secretion

3 討 論

糖皮質激素是一類由腎上腺皮質分泌、具有廣泛生理作用的類固醇激素，可調節(jié)機體的物質代謝、水鹽代謝并影響器官系統(tǒng)的功能,增強機體在應激反應中的抵抗力,同時還具有抗炎、抗休克和免疫抑制作用。糖皮質激素主要通過經(jīng)典途徑(基因組作用)和非經(jīng)典途徑(非基因組作用)發(fā)揮生物學效應，其中，非基因組作用在機體生理和病理過程中具有重要的生物學意義，但是其分子機制尚不明了[9]。

Pyk2，屬粘著斑激酶家族，廣泛分布于多種組織和細胞[10]。Pyk2活化同時可以進一步引起MAPK-Erk1/2信號轉導[11]，還可以通過GSK3β-Wnt/β-catenin信號通過調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12,13]。Pyk2作為一種活躍的非受體酪氨酸蛋白激酶，通過多種信號轉導方式及信號通路，參與多種生理活動，實現(xiàn)其生物學效應[10,14]。Pyk2磷酸化能進一步激活位于其信號通路下游的蛋白激酶Src[15]；Src激酶與GR形成穩(wěn)定的蛋白復合體，且糖皮質激素可刺激激活Src磷酸化[5,16]。有研究指出Pyk2的活化可以不需要受體或其他激酶的參與即可完成[10]，這與快速非基因組作用的方式一致。鑒于此，我們設計實驗，研究Pyk2磷酸化是否介導糖皮質激素快速反饋。

蛋白免疫印跡結果顯示，單獨采用CRH，或者皮質酮刺激細胞，可引起Pyk2位點402的快速磷酸化(10min)，這一反應與皮質酮快速抑制ACTH的分泌一致[4]。持續(xù)刺激時，磷酸化水平慢慢回落，接近正常生理水平。當同時添加CRH和皮質酮刺激時，Pyk2的磷酸化出現(xiàn)短期抑制趨勢，隨后快速升高(20min)。

我們的前期研究結果表明，GR介導了糖皮質激素的快速抑制作用[4]。我們應用了Pyk2抑制劑PF，研究PF對細胞內GR轉運的作用。蛋白免疫印跡結果顯示，PF不影響GR的細胞膜轉運，表明抑制Pyk2并不影響糖皮質激素的快速非基因組作用；PF阻止了受體向細胞核的轉運，表明Pyk2可能通過調控靶基因的轉錄激活或抑制，參與糖皮質激素的基因組作用。

我們進一步采用了垂體細胞灌注系統(tǒng)進行了驗證，結果與蛋白免疫印跡結果一致。PF不影響糖皮質激素激素對ACTH的快速抑制作用，卻引起了ACTH分泌延后的長期抑制，延后時間為50～60分鐘，與基因轉錄的最快時間大致相當。因此，綜合這些實驗結果，我們可以得出，Pyk2可能通過抑制GR向細胞核轉運，參與調控糖皮質激素的作用。但是，單獨皮質酮或CRH刺激引起的Pyk2的快速磷酸化的機制，以及可能參與的作用，仍然需要進一步深入的研究和探討。