劉兵

作者單位：自貢市第四人民醫(yī)院眼科，四川 自貢 643000

年齡相關(guān)性白內(nèi)障（age-related cataract，ARC）又稱老年性白內(nèi)障，是一種與年齡密切相關(guān)的白內(nèi)障疾病［1-2］。作為我國最常見的致盲性眼病，隨著全國人口平均壽命的延長，年齡相關(guān)性白內(nèi)障的患病率也在逐年增加［3-4］。關(guān)于老年性白內(nèi)障的預(yù)防及治療引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注。25羥維生素D（25-OH-VD）是維生素D在體內(nèi)的主要存在形式，作為人體中不可或缺的營養(yǎng)素之一，它不僅影響鈣磷的代謝，而且有廣泛的生理作用，是維持人體健康、細(xì)胞生長和發(fā)育的必不可少的物質(zhì)［5-6］。血清中25羥維生素D的高低可以反映人體維生素D的儲存水平，與多種疾病密切相關(guān)［7-8］。關(guān)于血清25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障關(guān)系的報道較少，其作用機(jī)制目前也不清楚。因此，本研究自2017年2月至2018年2月通過注射補(bǔ)充維生素D的方式調(diào)節(jié)血清內(nèi)25羥維生素D水平，觀察其對年齡相關(guān)性白內(nèi)障的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康1月齡SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量范圍為50～60 g，雌雄各半，購于北京維通利華有限責(zé)任公司，室溫、12 h∶12 h明暗交替喂養(yǎng)。動物合格證號：SCXK（京）2015-0001。本研究對大鼠的處置符合動物倫理學(xué)原則。

1.2 方法

1.2.1年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠模型構(gòu)建 Wistar大鼠采用1%阿托品滴眼液進(jìn)行散瞳處理后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、年齡相關(guān)性白內(nèi)障模型組、維生素D低劑量組（維生素D1 250 IU/d）、維生素D高劑量組（維生素D2 500 IU/d），每組10只。

實(shí)驗(yàn)開始前，對照組與模型組大鼠舌下靜脈注射10%葡萄糖溶液（5 mL/kg），維生素D對照組注射維生素D葡萄糖溶液。15 min后，除空白對照組外，其余三組均腹腔注射50%濃度的D-半乳糖生理鹽水注射液（劑量為25 g-1·kg-1·d-1），對照組注射等量的生理鹽水。連續(xù)注射3周并定期對大鼠進(jìn)行散瞳處理，觀察晶狀體渾濁情況。

注：本研究的造模方法“大鼠舌下靜脈注射10%葡萄糖溶液（5 mL/kg），維生素D對照組注射維生素D葡萄糖溶液。15 min后，除空白對照組外，其余三組均腹腔注射50%濃度的D-半乳糖生理鹽水注射液（劑量為25 g-1·kg-1·d-1）”，其誘發(fā)白內(nèi)障的原理是晶狀體前皮質(zhì)和核的混濁，其與臨床的青光眼性白內(nèi)障發(fā)病途徑比較接近。青光眼性白內(nèi)障即為青光眼引起的白內(nèi)障多由晶狀體前皮質(zhì)和核開始，逐漸使晶狀體全混濁。以后水分吸收，囊膜增厚，晶狀體囊膜皺縮，并有鈣化等變化。其關(guān)鍵病因即為晶狀體的變化，故檢測眼壓以明確其癥狀的進(jìn)展情況。

1.2.2眼壓及血清中25羥維生素D的檢測 采用眼壓計檢測大鼠眼壓，結(jié)果取3次平均值；采集外周血（眼底取血），EIA法測定血清中25羥維生素D的含量。

1.2.3晶狀體上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 大鼠頸處死后取晶狀體上皮組織，生理鹽水沖洗后剪碎并加入胰蛋白酶（1.5 g/L）消化培養(yǎng)25 min（37℃、5%二氧化碳）；然后加入含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，離心并用PBS洗滌，該過程重復(fù)3次。隨后調(diào)整細(xì)胞水平并接種于培養(yǎng)板上，細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞傳代3次后收集細(xì)胞，以便后續(xù)檢測。

1.2.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測DPPⅡ、cmycmRNA基因表達(dá)的變化 采用RT-PCR方法檢測DPPⅡ、c-mycmRNA基因表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件為：97℃預(yù)變性2.5 min，94℃變性30 s，60℃退火25 s，70℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸60 s。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和6 μL的DGL-200 Maker同時上樣，于2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增結(jié)果并拍照。DPPⅡ、c-myc以及βactin引物設(shè)計，見表1。

1.2.5免疫印跡（Western Blot）分析相關(guān)蛋白表達(dá)水平變化 配置一定濃度的SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠并置于電泳槽上，分別取各組條件下的蛋白15μL上樣并電泳。電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉并用TBST清洗后分別加入稀釋過的蛋白抗體（1抗），4℃過夜，TBST清洗4次（每次5 min）；隨后加入HRP標(biāo)記的2抗，37℃孵育2 h，TBST洗4次×5 min。設(shè)立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗，HRP標(biāo)記的IgG為二抗。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件（美國IBM公司）進(jìn)行處理；計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基本情況白內(nèi)障模型組、維生素D給藥組與空白對照組大鼠的基本情況見表1。由表1可知，對照組、模型組及各給藥組之間大鼠體質(zhì)量、收縮壓及舒張壓均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）且均在正常范圍內(nèi)，見表2。

表1 PCR過程中引物序列設(shè)計

表2 白內(nèi)障模型組、給藥組與對照組大鼠基本情況/±s

表2 白內(nèi)障模型組、給藥組與對照組大鼠基本情況/±s

組別空白對照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10體質(zhì)量/g 54.62±7.65 54.49±8.54 55.85±8.72 56.42±4.55 1.346 0.412收縮壓/mmHg 121.32±6.05 120.49±6.54 120.85±5.72 120.35±6.25 1.287 0.399舒張壓/mmHg 77.62±5.25 78.43±4.94 78.62±5.37 78.30±5.20 1.453 0.428

2.2 25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠眼壓的關(guān)系與空白對照組相比，白內(nèi)障模型組25羥維生素D水平降低，眼壓升高；維生素D給藥后，維生素D水平較模型組升高，眼壓降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（25羥維生素D水平：F＝9.215，P＝0.007；眼壓：F＝12.502，P＝0.005），且以高劑量給藥組效果最明顯，且隨著維生素D水平的升高，大鼠眼壓逐漸降低，見表3。

2.3 25羥維生素D水平與白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁情況的關(guān)系裂隙燈顯微鏡觀察可知，空白對照組大鼠始終保持晶狀體透明；注射3周后，白內(nèi)障模型組中2只晶狀體高度渾濁（3級），8只晶狀體呈肉眼可見的渾濁（4級）。姜黃素低劑量給藥后，4只大鼠晶狀體呈3級渾濁，6只大鼠晶狀體呈4級渾濁；高劑量給藥后，分別有2只、4只、6只大鼠呈現(xiàn)2級、3級和4級渾濁。綜合分析25羥維生素D水平與白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁情況可知，血清中維生素D水平越低，晶狀體渾濁程度越嚴(yán)重；給藥后，血清中維生素D水平有一定程度的恢復(fù)，晶狀體渾濁程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝11.635，P＝0.003），見表4。

表3 25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠眼壓的關(guān)系/xˉ± s

2.4 25羥維生素D水平對晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡的影響各組LEC細(xì)胞凋亡率均隨時間延長而緩慢增加；白內(nèi)障模型組晶體上皮細(xì)胞凋亡率高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝8.212，P＝0.016）；與模型組相比，給藥組各時間段的LEC細(xì)胞凋亡率下降，且以高劑量組降低效果最明顯。綜合分析25羥維生素D水平與LEC細(xì)胞凋亡率可知，血清中維生素D水平越低，LEC細(xì)胞凋亡率越高；給藥后，血清中維生素D水平有一定程度的回升，LED凋亡程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1周：F＝10.258，P＝0.0111；2周：F＝13.390，P＝0.005；4周：F＝14.157，P＝0.003），見表5。

2.5 血清中25羥維生素D水平對年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平的影響與對照組相比，白內(nèi)障模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。給藥后，隨著血清中25羥維生素D水平的回升，DPPⅡ、c-myc表達(dá)的降低，且血清中維生素D水平較高時降低效果更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，血清中25羥維生素D可有效抑制DPPⅡ、c-myc基因的表達(dá)，從而達(dá)到減緩并抑制白內(nèi)障的發(fā)病，見表6，圖1。

表5 25羥維生素D水平對晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡的影響/±s

表5 25羥維生素D水平對晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡的影響/±s

組別空白對照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 25羥維生素D水平/（ng/mL）21.53±4.25 19.20±2.63 26.46±3.51 35.32±4.52 8.212 0.016 LEC細(xì)胞凋亡率/%1周3.42±1.93 12.60±2.26 8.86±2.34 6.07±3.13 10.258 0.011 2周4.35±1.06 18.23±3.06 10.24±2.87 8.23±2.06 13.390 0.005 4周6.52±1.76 25.72±4.24 13.52±3.40 10.72±2.24 14.157 0.003

表6 血清中25羥維生素D水平對DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平的影響/（ng/mL，±s）

表6 血清中25羥維生素D水平對DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)水平的影響/（ng/mL，±s）

組別空白對照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 DPPⅡ（灰度值）1.31±0.06 4.18±0.21 2.31±0.72 2.03±0.40 11.217 0.008 c-myc（灰度值）1.02±0.05 3.89±0.31 2.25±0.62 1.91±0.41 13.087 0.005

圖1 RT-PCR檢測DPPⅡ、c-myc基因表達(dá)情況

2.6 血清中25羥維生素D水平對年齡相關(guān)性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平的影響與對照組相比，模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞TNF-α、IL-8蛋表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。給藥組與模型組相比，隨著血清中25羥維生素D水平回升，均有下調(diào)TNF-α、IL-8表達(dá)的效果，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且血清中維生素D水平較高時降低效果更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，血清中25羥維生素D可有效抑制TNF-α、IL-8基因的表達(dá)，從而達(dá)到減緩并抑制白內(nèi)障的發(fā)病，見表7，圖2。

表7 NE及BOD對感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平的影響/±s

表7 NE及BOD對感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平的影響/±s

指標(biāo)空白對照組白內(nèi)障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 TNF-α（灰度值）1.25±0.04 5.28±0.21 3.48±0.61 2.63±0.31 12.023 0.002 IL-8（灰度值）1.12±0.08 4.63±0.50 2.59±0.71 2.14±0.30 10.419 0.005

圖2 Western Blot檢測TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)情況

3 討論

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是一種與年齡相關(guān)的致盲率較高的晶狀體渾濁性疾?。?-10］。隨著年齡的增長，晶狀體中變性蛋白質(zhì)和脂質(zhì)不斷累積，在多種因素的綜合作用下導(dǎo)致白內(nèi)障疾病的產(chǎn)生［11-12］，其公認(rèn)的治療手段為手術(shù)治療，但早期白內(nèi)障術(shù)后療效不佳，部分病人不適于手術(shù)，因此預(yù)防就顯得尤為重要。

DPPⅡ（二肽基肽酶Ⅱ）作為一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體蛋白酶，廣泛存在于晶狀體中，與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)病密切相關(guān)［13］。c-myc基因是原癌基因家族的重要成員，與晶狀體上皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡密切相關(guān)，它的過度表達(dá)可促進(jìn)白內(nèi)障的發(fā)生［14-15］。TNF-α由LPS刺激過量產(chǎn)生，可通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞及誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生導(dǎo)致炎癥及組織損傷，在炎癥反應(yīng)中有重要作用［16-17］。IL-8是趨化因子家族的一員，有多重免疫調(diào)節(jié)功能，在囊性纖維化發(fā)病過程中起重要作用［18-20］。

本研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障模型組大鼠血清中25羥維生素D水平降低，眼壓較高；給藥后血清中維生素D水平上升，眼壓降低，即D-半乳糖誘導(dǎo)后，血清中25羥維生素D水平與眼壓負(fù)相關(guān)。而且，隨著血清中維生素D水平升高，可降低D-半乳糖誘導(dǎo)年齡相關(guān)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度，誘導(dǎo)建模后血清中25羥維生素D水平與晶體渾濁情況負(fù)相關(guān)。血清中維生素D水平越低，LEC細(xì)胞凋亡率越高；給藥后，血清中維生素D水平有較大程度的升高，LED凋亡程度降低，即誘導(dǎo)建模后血清中25羥維生素D水平與晶狀體上皮細(xì)胞LEC凋亡呈負(fù)相關(guān)。此外，血清中25羥維生素D可抑制DPPⅡ、c-myc的表達(dá)，下調(diào)TNF-α、IL-8水平，且高劑量給藥組抑制作用最強(qiáng)。血清中25羥維生素D可下調(diào)溶酶體蛋白酶DPPⅡ、原癌基因c-myc、癌細(xì)胞死亡因子TNF-α、炎癥因子IL-8的表達(dá)，保護(hù)晶狀體上皮細(xì)胞，延緩其凋亡，從而達(dá)到延緩年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的作用。本研究結(jié)果表明，血清中25羥維生素水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，這可能與其下調(diào)DPPⅡ、cmyc、TNF-α、IL-8的表達(dá)有關(guān)。但是其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討和研究。本研究提示，提高血清中25羥維生素D水平對年齡相關(guān)性白內(nèi)障的預(yù)防及治療有十分重要的意義，同時也為維生素D作為年齡相關(guān)性白內(nèi)障病人保健藥品的臨床應(yīng)用提供理論支持。

綜上所述，血清中25羥維生素D水平與年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)展負(fù)相關(guān)，這對于白內(nèi)障的預(yù)防及治療有十分重要的意義。