沈麗燕 余怡 王家雄 楊慎敏 王瑋 李紅

精子的形態(tài)學(xué)評(píng)估是精液分析的一個(gè)重要組成部分，精子形態(tài)與精子功能的關(guān)系已經(jīng)被很多報(bào)道所證實(shí)。精子頭部與精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其缺陷會(huì)影響體外受精和體內(nèi)受精的結(jié)局[1]，精子中段的缺陷也會(huì)影響輔助生殖的結(jié)局[2]，因此，精子形態(tài)評(píng)估已經(jīng)被用于確定男性精子的受精潛能以及預(yù)測輔助生殖的結(jié)局[3]。然而即使如此，精子形態(tài)評(píng)估的價(jià)值和必要性仍受到質(zhì)疑[4]。有研究者發(fā)現(xiàn)不同的染色和洗滌程序會(huì)對(duì)人類精子形態(tài)評(píng)估結(jié)果有明顯影響[5]。隨著輔助生殖技術(shù)，尤其是卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)的發(fā)展，精子形態(tài)學(xué)評(píng)估對(duì)那些有意接受體外受精的夫婦來說似乎變得不那么重要[6]。盡管精子形態(tài)能夠反映精子的受精能力，但檢測的精確度高度依賴于形態(tài)學(xué)缺陷的標(biāo)準(zhǔn)化分類和嚴(yán)格的質(zhì)量控制[7]。本研究對(duì)具體的精子形態(tài)缺陷與其運(yùn)動(dòng)參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在確定各種缺陷對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)是否有預(yù)測價(jià)值。

對(duì)象和方法

1.對(duì)象：2014年7月—2016年11月間于南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心接受檢查的男性3 775名，平均年齡(29.7±2.4)歲。納入研究患者均為健康男性，無嚴(yán)重慢性病史，排除了精液不完全液化，高粘度和精子凝集的樣本，以減少影響結(jié)果的因素。研究獲得我院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，知情同意書患者書面簽字。

2.標(biāo)本收集和檢測：

(1)精液的收集處理：患者禁欲2～7 d后，通過手淫采集精液樣本，置于37 ℃培養(yǎng)箱液化60 min后進(jìn)行分析。

(2)精液常規(guī)參數(shù)分析：根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南提出的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行精液評(píng)估[8]。精液參數(shù)包括：精液體積、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率(WHO等級(jí)a + b合并)、活動(dòng)精子百分率、運(yùn)動(dòng)速度有效精子濃度(Functional Sperm Concentration，F(xiàn)SC)(106/ mL)。通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析(computer-aided sperm analysis ，CASA)儀器進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估后，按照世界衛(wèi)生組織指南中指出的濃度和體積正常值的臨界值，排除異常濃度(<15×106/ ml)和體積(<1.5 mL)的標(biāo)本，以防止它們對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響。

(3)精子形態(tài)分析：精子涂片采用改良的巴氏法染色，1000倍油鏡觀察精子形態(tài)。檢查200個(gè)精子，重復(fù)兩次。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估形態(tài)學(xué)正常和異常精子的百分比。另外，在形態(tài)異常的精子中，監(jiān)測各類具體的頭部[錐形、梨形、圓形、不規(guī)則、空泡(超過2個(gè)空泡，或空泡區(qū)域占頭的20%以上)、頂體后區(qū)空泡、大頂體(頂體區(qū)域占頭的70%以上)、小頂體(頂體區(qū)域占頭的40%以下)、大頭、小頭、 雙頭]，頸部(異常粗、彎折、非對(duì)稱性插入、異常細(xì)、不規(guī)則)，尾部缺陷(短、多尾、發(fā)卡樣彎曲、斷裂、成角彎曲、卷曲)和胞漿殘余體的百分比。

結(jié)果

經(jīng)過篩選后我們獲得2 883個(gè)可用樣本。精液平均濃度為(59.4±37.5)×106/ mL。表1顯示了標(biāo)準(zhǔn)精子參數(shù)和每個(gè)形態(tài)學(xué)缺陷的百分比。

研究發(fā)現(xiàn)精子形態(tài)缺陷與精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)有關(guān)。如表2所示，錐形頭的精子速度較低，頭部梨狀可能導(dǎo)致前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、速度和FSC下降。圓頭會(huì)影響精子的前向運(yùn)動(dòng)和FSC，同時(shí)速度和FSC會(huì)因?yàn)椴灰?guī)則頭部增多而減少。另外，頂體小的精子會(huì)影響所有四個(gè)運(yùn)動(dòng)參數(shù)。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，彎曲的尾巴會(huì)影響FSC。此外，頸部彎折，卷尾和短尾的百分比與活動(dòng)精子百分率呈顯著負(fù)相關(guān)。有趣的是，頸部異常粗與精子活力顯示出意想不到的正相關(guān)。其余缺陷與這四個(gè)運(yùn)動(dòng)參數(shù)未呈現(xiàn)相關(guān)性。

繪制不同形態(tài)缺陷百分比的ROC曲線，大部分ROC曲線與相關(guān)分析結(jié)果相符。本研究發(fā)現(xiàn)用短尾異常精子所占百分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)速度是否異常的AUC最大。而尾部卷曲評(píng)價(jià)活動(dòng)精子百分率和前向運(yùn)動(dòng)精子百分率AUC在所有曲線中最大。

表2 精子運(yùn)動(dòng)特征與精子形態(tài)異常相關(guān)性

△表中未列出的形態(tài)學(xué)缺陷與精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)無顯著相關(guān)性。*P<0.05;**P<0.01；“-”：負(fù)相關(guān)；“+”:正相關(guān)；NA：無數(shù)據(jù)

表3 不同缺陷評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)參數(shù)ROC曲線的曲線下面積

討論

精子形態(tài)學(xué)評(píng)估可用于評(píng)估精子質(zhì)量和受精能力。評(píng)估的準(zhǔn)確性高度依賴于標(biāo)準(zhǔn)的合理性。由于精子形態(tài)是臨床醫(yī)生較為感興趣的精液參數(shù)之一[9]世界范圍內(nèi)逐漸出現(xiàn)了很多不同的畸形分類標(biāo)注：MacLeod J[10],Bisson JP[11]，Jouannet P[12]等人相繼推出了行之有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)，隨后Kruger TF等[13]在嚴(yán)格形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上提出自己的精子分類，并被臨床實(shí)驗(yàn)室迅速廣泛應(yīng)用。最后，世界衛(wèi)生組織提出統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為比舊標(biāo)準(zhǔn)更可靠[14]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)，精子形態(tài)學(xué)缺陷可分為頭部缺陷，頸部或稱中段缺陷、主段缺陷和胞漿殘余體(excess residual cytoplasm，ERC)四部分。前三部分可以細(xì)分為多個(gè)類別。盡管精子形態(tài)學(xué)缺陷經(jīng)常被報(bào)道與精子活力密切相關(guān)，但迄今為止還很少有關(guān)于詳細(xì)缺陷與活動(dòng)性之間關(guān)系的研究。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)不同的精子形態(tài)缺陷與活動(dòng)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)之間存在關(guān)聯(lián)。本研究觀察到具有錐形頭部的精子傾向于具有較低的速度。Andrade-Rocha FT[15]的研究發(fā)現(xiàn)精索靜脈曲張男性表現(xiàn)出類似的活力受損，活動(dòng)性隨著錐形頭部精子的增加而降低。此外，本研究結(jié)果還表明，具有梨狀頭的精子可能與較低的強(qiáng)向運(yùn)動(dòng)精子百分率、速度和FSC有關(guān)。Rousso等[16]2002年的報(bào)道聲稱梨形頭雖然不能妨礙尾巴移動(dòng)，但是具有梨形頭的精子的其它部位總是比正常頭部的精子更頻繁地出現(xiàn)異常，這可能潛在的影響精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)。本研究還觀察到，圓形和無定形頭部的精子也可能使精子活力異常。Liao等[17]認(rèn)為，圓形精子中外層致密纖維蛋白2的表達(dá)水平較低，而這直接影響精子鞭毛的超微結(jié)構(gòu)，可能解釋圓頭精子的低運(yùn)動(dòng)性。Sivanarayana T等[18]的研究表明頭部異常，包括無定形頭部，與染色質(zhì)堆積異常和DNA碎片發(fā)生率較高有關(guān)，這可能導(dǎo)致精子活力降低。此次研究結(jié)果表明頂體小的精子運(yùn)動(dòng)異常，小頂體區(qū)域是由于精子頭部發(fā)育不良造成的，這可能會(huì)降低精子活力?？傊狙芯空J(rèn)為引起頭部異常的可能是遺傳缺陷，也可能是活性氧[19]，而頭部缺陷可能意味著DNA或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常，而這些都已被證明對(duì)精子活動(dòng)能力有負(fù)面影響[20]。此外，不規(guī)則的頭部形狀也可能會(huì)阻礙精子的運(yùn)動(dòng)。

Hu Y等的研究證實(shí)，頸部彎折與精子活動(dòng)力呈負(fù)相關(guān)，他們發(fā)現(xiàn)彎曲中段精子的低運(yùn)動(dòng)性和降低的Galpha12表達(dá)有關(guān)[21]。有趣的是，本研究結(jié)果顯示，頸部異常粗與動(dòng)力呈正相關(guān)。線粒體是精子運(yùn)動(dòng)的主要能量提供者，而線粒體鞘主要分布在精子的中間部分[22]，據(jù)報(bào)道線粒體鞘的紊亂與彎曲的頸部相關(guān)[23]。因此，本研究將頸部彎折引起的異常運(yùn)動(dòng)歸咎于異常的線粒體鞘，這可能導(dǎo)致提供的能量減少。同樣的，本研究推測異常粗中段擁有線粒體較多的線粒體鞘。因此，關(guān)于中段異常粗帶來的運(yùn)動(dòng)性增加的原因，懷疑是線粒體鞘提供更多能量的結(jié)果，不過仍有待研究。

精子尾部鞭毛是精子活動(dòng)的重要組件，其畸形與精子活動(dòng)力有著直接的聯(lián)系，最主要原因可能就是尾部鞭毛畸形不僅僅是外部形態(tài)的異常，往往還涉及內(nèi)部微管等動(dòng)力組件超微結(jié)構(gòu)的紊亂。臨床有一類病癥為精子鞭毛多發(fā)性形態(tài)異常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF)，其表現(xiàn)為大多數(shù)精子不運(yùn)動(dòng)或活動(dòng)力較低，而精子尾部出現(xiàn)嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)畸形，其中就包括尾部短、卷曲、彎折以及粗大[24]。本研究發(fā)現(xiàn)精子尾部成角彎折多，會(huì)降低精液的FSC，這一現(xiàn)象在其他研究中從未被提及過，F(xiàn)SC是CASA系統(tǒng)通過活動(dòng)力計(jì)算出的一個(gè)指標(biāo)，F(xiàn)SC降低意味著精子的活動(dòng)力差。在Chao HC[25]等的報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)尾部彎折和SEPTIN7蛋白編碼基因喪失有關(guān)，而SEPTIN蛋白與許多微管相關(guān)蛋白有相互作用，鞭毛組裝的異常嚴(yán)重影響精子活力。短尾精子一直是我們課題組關(guān)注的重點(diǎn)，其百分率增多會(huì)影響精子活力。另外，尾部卷曲和運(yùn)動(dòng)參數(shù)之間也觀察到顯著的負(fù)相關(guān)。Yeung CH等[26]也做過類似的報(bào)道，指出尾部卷曲精子百分比與前向運(yùn)動(dòng)精子率之間顯著的負(fù)相關(guān)性。

綜上所述，詳細(xì)的精子形態(tài)學(xué)缺陷的各個(gè)部分與精子活力密切相關(guān)，具有一定的臨床參考價(jià)值。盡管如此，其應(yīng)用還需要進(jìn)一步改進(jìn)，以更好地反映精子活力，為精確的受精潛力臨床評(píng)估提供參考。