秦聰 楊飛

710032 西安，中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西京醫(yī)院)心血管外科(秦聰)；710032 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬西安中醫(yī)腦病醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科(楊飛)

冠心病是臨床常見疾病。近年來，隨著微小RNA(microRNA，miR)組學(xué)的出現(xiàn)及雙生子經(jīng)典研究途徑的發(fā)展，使冠心病調(diào)控因子的研究進(jìn)入了全新階段。為了尋找冠心病實(shí)際調(diào)控miRs，本研究首次在miR的基礎(chǔ)上，引入雙生子研究疾病基因特征的經(jīng)典方法，以兩對冠心病-健康雙生子為研究對象，篩選出了冠心病發(fā)生調(diào)控的差異miRs，并初步分析了miRs在冠心病調(diào)控中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇在中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西京醫(yī)院)就診的兩對男性冠心病-健康同卵雙生子(經(jīng)過DNA鑒定)作為研究對象，一般資料見表1。其中2例經(jīng)詢問病史、體格檢查、心電圖、心電圖平板運(yùn)動試驗(yàn)、冠狀動脈造影檢查明確診斷冠心病[1]，且近3個月無疾病和用藥史。其他2名健康者無冠心病臨床癥狀、體征，經(jīng)體檢專家診斷、影像學(xué)檢查均顯示體健，且近3個月無疾病和用藥史，為對照組。兩對同卵雙生子均無冠心病家族史。實(shí)驗(yàn)均知情，且通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

晨起空腹采集研究對象肘靜脈血5 ml，使用TRIzol法提取總RNA，并用RNasey Mini Kit (QIAGEN)純化。使用NanoDrop ND-1000測量純化后的RNA濃度，電泳檢測RNA完整性。使用Wash buffer kit (Exiqon)清洗芯片。通過對miR芯片和基因芯片質(zhì)控點(diǎn)的計算，歸一化處理原始數(shù)據(jù)，將處理后的數(shù)據(jù)按照4次重復(fù)取中間值做標(biāo)準(zhǔn)化，再計算研究組與對照組的比值，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果剔除信號過低的點(diǎn)，進(jìn)行差異判斷。使用差異倍數(shù)比值(fold change)和P值進(jìn)行差異表達(dá)的miRs篩選。應(yīng)用miR生物信息學(xué)軟件MicroCosm、TargetScan和 MIRDB對芯片檢測差異表達(dá)的miRs進(jìn)行靶基因預(yù)測，選擇至少兩種軟件交集的靶基因做進(jìn)一步分析。采用在線分析軟件DAVID對靶基因進(jìn)行GO注釋及富集KEGG通路分析。運(yùn)用Cytoscate軟件繪制冠心病miR和靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖像，通過分析網(wǎng)絡(luò)尋找中心節(jié)點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Student’st-test、Fisher精確概率法計算P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冠心病總RNA質(zhì)量檢測報告

在兩對冠心病-健康者雙生子中，對提取的總RNA進(jìn)行紫外吸收法和瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，所有樣本總RNA的OD260/OD280介于1.8～2.0之間，符合RNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，4個組織樣本的總RNA均符合基因芯片的質(zhì)量需要，見表2。

2.2 miR芯片表達(dá)數(shù)據(jù)的處理結(jié)果

對各組中各樣本總RNA進(jìn)行相應(yīng)處理后與miRCURYTM LNA芯片進(jìn)行雜交，并使用Axon公司的GenePix 4000B微陣列芯片信號掃描儀掃描，使用GenePix Pro V.6.0 軟件讀取掃描圖像中的原始熒光信號強(qiáng)度。如圖1顯示，各組內(nèi)各個重復(fù)實(shí)驗(yàn)的芯片之間一致性較高，芯片實(shí)驗(yàn)質(zhì)量較好，各組芯片數(shù)據(jù)之間具有可比性且可信度較高。

2.3 篩選差異表達(dá)的miRs

利用差異倍數(shù)比值和P值(默認(rèn)差異倍數(shù)比值≥2，P≤0.05)對兩組樣本進(jìn)行差異表達(dá)miRs的挑選，結(jié)果在冠心病和健康者之間共篩選出43個顯著差異表達(dá)的miRs(已經(jīng)隨機(jī)抽取驗(yàn)證)，其中12條表達(dá)上調(diào)，31條表達(dá)下調(diào)，顯著變化的有7條，主要為下調(diào)miRs，其中最為顯著的hsa-miR-338-5p、hsa-miR-1066-5p、hsa-miR-3074-3p、hsa-miR-4505、hsa-miR-3658和hsa-miR-4459分別下調(diào)10倍以上，hsa-miR-4699-3p上調(diào)8倍以上，見表3。

表1 研究對象一般資料

注：a血脂參考值：總膽固醇<5.18 mmol/L，三酰甘油<1.7 mmol/L，低密度脂蛋白膽固醇<3.37 mmol/L，高密度脂蛋白膽固醇>1.04 mmol/L

表2 冠心病總RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

圖1 實(shí)驗(yàn)的芯片熒光信號強(qiáng)度相關(guān)性

表3 冠心病患者差異表達(dá)顯著的miRs信息

2.4 靶基因預(yù)測

分別從MirBase、TargetScan和MIRDB數(shù)據(jù)庫調(diào)取顯著差異表達(dá)miRs靶基因信息。篩選數(shù)據(jù)庫中共有的miRs靶基因數(shù)據(jù)作為靶基因預(yù)測結(jié)果，見表4。

表4 miRs部分靶基因

2.5 差異表達(dá)miRs靶基因GO分析

在生物學(xué)過程方面(go biological process)，差異表達(dá)miRs靶基因主要與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程及生物合成等相關(guān)，見表5。

表5 差異表達(dá)miRs靶基因在生物學(xué)過程方面的分析結(jié)果

在分子功能方面(molecular function)，差異表達(dá)miRs靶基因主要與離子結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄等相關(guān)，見表6。

表6 差異表達(dá)miRs靶基因在分子功能方面的分析結(jié)果

在細(xì)胞成分方面(go cell component)，差異表達(dá)miRs靶基因主要與細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器調(diào)控等有關(guān)，見表7。

表7 差異表達(dá)miRs靶基因在細(xì)胞成分方面的分析結(jié)果

2.6 差異表達(dá)miRs靶基因KEGG Pathway分析結(jié)果

通過對差異表達(dá)miRs靶基因進(jìn)行Pathway通路分析，共有46條通路，顯著差異表達(dá)miRs靶基因相關(guān)通路主要有T/B細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、Wnt信號通路和MAPK信號通路，見表8。

2.7 miR-DiffGene-Network調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

以miR為基礎(chǔ)，通過靶基因預(yù)測，構(gòu)建miR-靶基因-Network調(diào)控圖后發(fā)現(xiàn)，一個靶基因可以受多個miRs調(diào)節(jié)，miR可以同時調(diào)控多個靶基因，其中TLR1、TLR2、CD180、MAPK、TLR8受hsa-miR-338-5p、hsa-miR-1066-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-4699-3p、hsa-miR-4505、hsa-miR-3658和hsa-miR-4459的共同調(diào)節(jié)，每個miR同時調(diào)控著多個靶基因，見圖2。

表8 部分差異表達(dá)miRs靶基因的相關(guān)通路和功能

從miR-DiffGene-Network調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖中可見，冠心病患者差異表達(dá)的hsa-miR-338-5p、hsa-miR-1066-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-4699-3p、hsa-miR-4505、hsa-miR-3658和hsa-miR-4459調(diào)控了多個靶基因，如TLR1、TLR2、CD180、MAPK、TLR8、BCL10、PPARD、PLCB1、PPP3R1、DLG1、MAPK1、MAPK9、MAP3K8等，其中TLR1和TLR2均受到上述差異表達(dá)的miRs的調(diào)控。同時，hsa-miR-4699-3p調(diào)控了多個免疫基因，推測miR-4699-3p-TLR1/TLR2在冠心病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著核心角色。

3 討論

雙生子方法一直是研究疾病特征的經(jīng)典途徑。雙生子差異基因篩選，是評估遺傳和環(huán)境對人類影響的最經(jīng)典設(shè)計。同卵雙生子自身基因變異小，產(chǎn)生的差異基因表達(dá)較少，作為病例或?qū)φ昭芯刻禺愋誀畹幕虮磉_(dá)具有潛在優(yōu)勢，是研究基因差異性的首選方法。Iwashita等[2]用患病-健康的同卵雙生子篩選多發(fā)性骨髓瘤的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)兩者間僅有3.2%的基因存在差異。Munshi等[3]利用同卵雙生子的骨髓制備成骨細(xì)胞樣培養(yǎng)物進(jìn)行全基因組基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，以探討骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控基因。由于同卵雙生子差異基因變化較小，而基因是癥狀表型調(diào)控的基礎(chǔ)，所以同卵雙生子用于冠心病差異表達(dá)基因的篩選，對于其發(fā)病機(jī)制的研究，具有科學(xué)性和優(yōu)越性。

miRNA組學(xué)是近年來一個新的研究領(lǐng)域，通過miR的鑒定和功能分析，為疾病的機(jī)制研究和治療提供新的思路[4]。段練[5]、劉佳[6]的研究均發(fā)現(xiàn)，miR在冠心病癥狀調(diào)控中有重要作用，對預(yù)防冠心病心血管事件具有重要意義。然而即使如此，近年來miR在冠心病中的研究卻無一個定性的結(jié)果。既往研究顯示，冠心病患者存在大量的差異表達(dá)miR，后期生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大量的BP、MF、CC、KEGG pathway等對精確疾病的實(shí)際調(diào)控因子造成了干擾，給分析結(jié)果的可靠性帶來了不確定因素。同時健康個體間存在差異表達(dá)miR，這些差異表達(dá)的miR可能與所研究疾病無關(guān)，但在常規(guī)研究途徑中，個體間差異miR無法排除，這些與疾病無關(guān)的miR會造成大量的干擾調(diào)控因子，這些干擾調(diào)控因子很難判判斷是否在疾病中起作用，最終使研究結(jié)果出現(xiàn)大量的相關(guān)數(shù)據(jù)，卻無法得到一個定性的結(jié)果。針對這一問題，有專家提出加大樣本量，嚴(yán)格控制篩查前的差異因素，來減少誤差，但實(shí)踐發(fā)現(xiàn)加大樣本量不但增加了研究成本，反而會增加篩選的數(shù)據(jù)量，研究者始終無法擺脫大數(shù)據(jù)這一困境。且健康個體間差異因素始終無法解決，加上增加樣本量所帶來的費(fèi)用投入，小樣本量的實(shí)驗(yàn)又缺乏統(tǒng)計學(xué)意義，導(dǎo)致大量研究者不得不放棄冠心病miR的研究。近年來，同卵雙生子經(jīng)典研究途徑的出現(xiàn)為冠心病miR研究帶來了新希望。同卵雙生子研究疾病基因特征的經(jīng)典途徑徹底解決了以上難題。雙生子又稱雙胞胎，同卵雙胞胎指兩個胎兒由一個受精卵發(fā)育而成。它具有個體差異表達(dá)miR少、定性研究結(jié)果簡單、需要研究樣本量少、研究費(fèi)用低等特性，適合于科學(xué)研究。同卵雙胞胎是研究疾病差異表達(dá)基因的最佳途徑，有效避免了個體間差異miR的干擾，極大地減少了篩查的樣本量，降低了研究成本，減少了篩查的數(shù)據(jù)，為后期精確疾病調(diào)控因子奠定了基礎(chǔ)。

圖2 miR-靶基因-Network調(diào)控圖

本研究中，對冠心病雙生子miRNA組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者差異miRs表達(dá)譜，在這些差異表達(dá)miRs中，發(fā)現(xiàn)43個miRs中有31個表達(dá)下調(diào)，12個表達(dá)上調(diào)，差異表達(dá)倍數(shù)在10倍以上者均出現(xiàn)在下調(diào)組中，分別為hsa-miR-338-5p、hsa-miR-1066-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-4505、hsa-miR-3658和hsa-miR-4459，hsa-miR-4699-3p下調(diào)8倍。通過靶基因預(yù)測、構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖發(fā)現(xiàn)，TLR1、TLR2、MAPK和CD180均受到hsa-miR-338-5p、hsa-miR-1066-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-4699-3p、hsa-miR-4505、hsa-miR-3658和hsa-miR-4459的調(diào)控，由此推測TLR1、TLR2、MAPK和CD180可能在冠心病的發(fā)病中扮演重要角色，除這4種靶基因外，本研究中還發(fā)現(xiàn)了其他多種可能與冠心病相關(guān)的靶基因，如PIK3R1、PLCG1、PPP3R1、PDK1、SOS2、AKT3和RAF1等，在冠心病中表達(dá)水平也發(fā)生了顯著變化，這可能是冠心病發(fā)病機(jī)制未來研究的方向。

GO分析表明，“免疫應(yīng)答與轉(zhuǎn)錄調(diào)控”是最顯著富集的項(xiàng)目，“炎癥反應(yīng)”被定為最顯著富集途徑。其中TLR1、TLR2、CD180、MAPK、TLR8、BCL10、PPARD、PLCB1、PPP3R1、DLG1、MAPK1、MAPK9和MAP3K8等參與了“免疫應(yīng)答”的調(diào)控，表明炎癥與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。KEGG顯示，多條免疫通路如T/B細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路等均參與了冠心病分子機(jī)制的調(diào)控，其中JAK-STAT信號通路中參與調(diào)控的靶基因數(shù)最多，包含了TLR1、TLR2、CD180和MAPK等。TLR1/2通路活化可促進(jìn)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)增殖，并增強(qiáng)PBMC對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC)的免疫殺傷效應(yīng)，熒光定量PCR結(jié)果表明UCMSC中多個免疫相關(guān)因子被TLR1/2明顯誘導(dǎo)，如白細(xì)胞介素(IL-2、IL-6、IL-10、IL-12)、干擾素γ、核因子κB、腫瘤壞死因子α；TLR1/2不影響UCMSC的定向分化能力。因此，TLR1/2可改變UCMSC的免疫狀態(tài)，在一定程度上誘導(dǎo)針對UCMSC的免疫攻擊[9]。駱菲菲等[10]研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR1/2可有效上調(diào)荷瘤機(jī)體CD8+T細(xì)胞TLR1和TLR2分子的基因和蛋白水平，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞分泌功能性細(xì)胞因子干擾素γ、IL-2，這一效應(yīng)依賴于核因子κB和P38通路。表明TLR1/2信號直接作用于荷瘤小鼠的CD8+T細(xì)胞并促進(jìn)其功能，該研究既豐富了TLR的作用范圍，也為基于TLR激動劑的腫瘤生物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。JAK1-STAT3信號途徑參與了免疫調(diào)節(jié)，JAK1和STAT3屬于促炎基因[11]。在冠心病研究中發(fā)現(xiàn)，JAK1和STAT3基因共同受到hsa-miR-4699-3p的調(diào)節(jié)，而在冠心病中hsa-miR-4699-3p的表達(dá)是上調(diào)的，其可能抑制了JAK1和STAT3基因的翻譯表達(dá)，影響JAK1-STAT3信號途徑，達(dá)到減輕或抗炎的作用，從而修復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)的紊亂。推測hsa-miR-4699-3p屬于炎癥修復(fù)基因，是機(jī)體免疫紊亂自我修復(fù)分子。

本研究利用雙生子經(jīng)典途徑最終發(fā)現(xiàn)，冠心病的發(fā)生與miR調(diào)控的炎癥因子密切相關(guān)，其中miR-4699-3p-TLR1/TLR2的調(diào)控關(guān)系可能成為今后冠心病基因治療的靶點(diǎn)。

利益沖突：無