余建萍 鄒顯巍 張黎黎 何仲春 馬 碧

抗血小板治療是影響頸動脈血管內(nèi)支架置入術(shù)(Carotid Artery Stenting，CAS)后遠(yuǎn)期通暢率的重要因素[1]。目前，氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療是臨床常用策略。調(diào)控氯吡格雷代謝相關(guān)活性基因CYP2C19具有高度多態(tài)性，其正常基因型為*1/*1 型，常見的無功能突變?yōu)镃YP2C19*2型和CYP2C19*3型，當(dāng)CYP2C19基因發(fā)生無功能突變后，編碼出來的酶的活性會減弱或喪失，直接影響氯吡格雷的代謝過程，最終減弱其抗血小板聚集的能力[2-4]。本研究旨在分析CYP2C19基因多態(tài)性對CAS術(shù)后氯吡格雷抗血小板治療患者發(fā)生氯吡格雷抵抗(CR)和支架內(nèi)血栓形成影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 對象和分組

收集2014-10—2015-10本院收治的缺血性腦血管病[5]需行CAS治療的患者80例，其中男53例，女27例；年齡50-75歲，平均65.58±8.15歲；腦卒中29例，冠心病17例，高血壓62例，糖尿病30例，高血脂癥36例，吸煙40例，飲酒33例。不同CYP2C19基因型患者的一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 患者一般資料比較

1.2 病例納入、排除及實驗終止標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床上診斷為缺血性腦血管病者；(2)行頸動脈血管內(nèi)支架置入術(shù)者；(3)需長期服用氯吡格雷者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血小板計數(shù)<80×109/L；(2)凝血功能異常者；(3)有嚴(yán)重肝臟疾病者；(4)術(shù)前3個月內(nèi)有服用氯吡格雷者；(5)既往有顱內(nèi)出血病史者；(6)合并其它疾病可顯著影響治療方案及預(yù)后者；(7)抗血小板治療禁忌證者。實驗終止標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者出現(xiàn)嚴(yán)重凝血功能障礙；(2)有局部或全身出血表現(xiàn)的不良事件；(3)出現(xiàn)意外傷殘、病死事件時應(yīng)立即終止實驗。

1.3 儀器、試劑和主要藥物

上海百傲科技有限公司CYP2C19基因檢測試劑盒(批號2014104436851)，Qiagen DNA提取試劑盒(產(chǎn)品貨號 51304)，BR-526-24全自動雜交儀、BE-2.0生物芯片識讀儀。Roche公司的Light Cycler 480 擴(kuò)增檢測儀，美國Helena公司PACK-4多通道血小板聚集儀，拜耳醫(yī)藥保健有限公司阿司匹林腸溶片(國藥準(zhǔn)字J20130078)，賽諾菲(杭州)制藥有限公司氯吡格雷片(國藥準(zhǔn)字J20130083)。

1.4 患者治療流程

患者入院后于手術(shù)前采集外周靜脈血檢測CYP2C19基因型?；颊哂谛g(shù)前3天和術(shù)后3月給予口服阿司匹林腸溶片(100mg/天)和氯比格雷片(75mg/天)。所有患者在術(shù)后第7 天采集外周靜脈血檢測血小板聚集率(PAR)。出院后采用電話隨訪3個月，主要終點事件為支架內(nèi)血栓形成。

1.5 CYP2C19基因型檢測

術(shù)前抽取外周靜脈血5ml于EDTA抗凝管中，按試劑盒說明書提取全血DNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為19μl，擴(kuò)增條件為94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃60s，連續(xù)36個循環(huán)，最后72℃7 min，4℃保存。設(shè)立空白對照樣本和5%的重復(fù)樣本，以評價檢測結(jié)果的可靠性。取出雜交顯色試劑盒，按試劑盒說明書操作，使用BR-526-24全自動雜交儀，通過多重高溫連接酶檢測反應(yīng)進(jìn)行基因分型檢測，雜交顯色反應(yīng)結(jié)束后取出芯片放入BE-2.0生物芯片讀取儀中讀取結(jié)果。CYP2C19基因可分為*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3型，各基因型芯片結(jié)果見圖1。

1.6 血小板聚集率檢測

患者服用氯吡格雷7天后取靜脈血2ml，加至0.5ml枸緣酸鈉溶液(1∶9)混勻，經(jīng)2 400r/min離心10min后獲取富血小板血漿，稀釋至250×109個/L，采用血小板聚集儀自動測定患者PAR。CR：PAR>50%，NCR：PAR≤50%[6]。

圖1 CYP2C19各基因型芯片結(jié)果

1.7 支架內(nèi)血栓形成檢測

采用頸動脈彩超(美國GE公司Vivid3型彩色多普勒超聲診斷儀)定期檢查支架內(nèi)血栓形成情況[7]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 80例患者CYP2C19基因分型結(jié)果

80例患者CYP2C19基因篩查中，*1/*2基因型所占比率最高，為37.50%(30/80)，其次為*1/*1基因型(31.25%，25/80)。CYP2C19基因無功能突變(*2、*3)所占比率為68.75%(52/80)，攜帶一個無功能突變基因(*1/*2型30例、*1/*3型6例)所占比率為45.00%，同時攜帶2個無功能突變基因(*2/*2型12例、*2/*3型4例、*3/*3型3例)所占比率為23.75%。CYP2C19基因的三種等位基因頻率(*1、*2、*3)分別為53.75%、36.25%、10.00%。

2.2 CYP2C19*2與CYP2C19*3攜帶者CR發(fā)生率和支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率比較

80例患者CR總發(fā)生率為25.00% (20例)，術(shù)后3個月支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率為16.25% (13例)。CYP2C19*2基因攜帶者(*1/*2、*2/*2)CR發(fā)生率為25.87%(14/42)，支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率為23.81%(10/42)，高于CYP2C19*3基因攜帶者(*1/*3、*3/*3)CR發(fā)生率(22.22%，2/9)和支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率(11.11%，1/9)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2均>74.178，P<0.01)。

3 討 論

隨著人口的老齡化和人們生活水平的提高，動脈粥樣硬化的發(fā)病率逐年上升。同時由于檢查手段和治療手段的提高，越來越多的患者接受了CAS治療，且患者術(shù)后需長期服用抗血小板聚集藥物預(yù)防手術(shù)部位血管再狹窄[8, 9]。支架內(nèi)血栓形成是影響患者預(yù)后的主要并發(fā)癥，其影響因素包括抗血小板藥物抵抗、支架的物理刺激、內(nèi)膜長期增生、慢性炎癥作用等[10, 11]。目前，臨床最常用的抗血小板藥物有阿司匹林腸溶片和氯吡格雷等。在CAS術(shù)后抗血小板治療中，氯吡格雷強大的抗血小板作用突出，可有效降低術(shù)后并發(fā)癥和心血管不良事件的發(fā)生率[12]。

氯吡格雷是一種噻吩吡啶類前體藥物，主要經(jīng)CYP450酶系主導(dǎo)的多步氧化過程來轉(zhuǎn)化成有活性的物質(zhì)，從而產(chǎn)生抗血小板聚集作用[13]。美國食品藥品管理局警示醫(yī)生開具氯吡格雷藥物前，必須了解患者CYP2C19基因突變的情況。Shuldiner等[14]研究表明冠狀動脈支架術(shù)后CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷的藥物療效明顯相關(guān)。CYP2C19是非常關(guān)鍵的一個代謝酶，其表現(xiàn)為基因多態(tài)性，其中亞洲人群中CYP2C19酶活性抑制歸因于其突變CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型[15]。在我國人群中CYP2C19*2、CYP2C19*3等位基因發(fā)生頻率分別為25%-30%、2%-7%[16]，故氯吡格雷的療效存在很大的個體差異，有服藥后抗栓不足的風(fēng)險。氯吡格雷代謝離不開CYP2C19酶，作為體內(nèi)代謝活化的關(guān)鍵酶，且基因多態(tài)性決定了個體間該酶活性的多樣性，并影響氯吡格雷代謝產(chǎn)物的濃度差異及抗血小板作用的多樣性[17]。目前國內(nèi)關(guān)于服用氯吡格雷CAS患者CYP2C19基因檢測報道較少，本研究以基因為導(dǎo)向，通過對CAS患者CYP2C19基因檢測分組，分析不同CYP2C19基因型與患者CAS后CR發(fā)生率和支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率的差異。

80例CAS患者CYP2C19基因篩查中，*1/*2基因型所占比率最高，其次為*1/*1基因型。CYP2C19基因無功能突變(*2、*3)所占比率為68.75 %，攜帶一個無功能突變基因(*1/*2、*1/*3)所占比率為45.00 %，同時攜帶2個無功能突變基因(*2/*2、*2/*3、*3/*3)所占比率為23.75%。2015年，Li等[18]發(fā)現(xiàn)在中國人群CYP2C19基因多態(tài)性是支架內(nèi)血栓形成唯一的獨立預(yù)測因子，與亞臨床血栓的發(fā)生關(guān)系密切，且發(fā)現(xiàn)突變基因CYP2C19*2與血栓形成有關(guān)。本研究顯示，攜帶等位基因CYP2C19*2型患者的CR發(fā)生率與支架內(nèi)血栓形成發(fā)生率均高于等位基因CYP2C19*3攜帶者，與上述研究結(jié)果基本一致。這表明等位基因CYP2C19*2型與患者CR及支架內(nèi)血栓形成息息相關(guān)，可指導(dǎo)CAS患者術(shù)后的遠(yuǎn)期預(yù)后，意義重大。

綜上所述，攜帶CYP2C19*2基因是CAS術(shù)后氯吡格雷抗血小板治療患者CR發(fā)生與支架內(nèi)血栓形成的重要因素，影響患者預(yù)后。對于CYP2C19基因發(fā)生無功能突變的患者，特別是CYP2C19*2基因型突變者，該如何使用抗血小板藥物還需要前瞻性大樣本臨床隨機對照研究來進(jìn)行驗證。