胡金成 張黎軍

急性心力衰竭的主要發(fā)生機制為左室收縮功能嚴(yán)重受損，目前已成為年齡超過65歲患者住院的主要原因[1]。心房利鈉肽前體A(NPPA)基因遺傳多態(tài)性與心血管疾病的關(guān)系已成為臨床研究的熱點[2]。但有關(guān)左心衰患者NPPA基因多態(tài)性與感染關(guān)系的報道所見尚少。本文回顧性分析急性左心衰是否合并肺部感染時NPPA基因多態(tài)性分布差異以及感染狀態(tài)患者不同基因型的炎癥標(biāo)記物降鈣素原(PCT)和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，為進一步認(rèn)識NPPA基因與急性左心衰及其感染的關(guān)系提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例和分組

2014-03—2016-04，本院心內(nèi)科收治急性左心衰患者120例，其中60例患者未合并肺部感染，作為左心衰組，60例患者合并肺部感染，作為左心衰感染組。另選同期來本院進行體檢的非左心衰或非左心衰合并感染人群60例作為對照組。三組一般資料比較見表1。其性別、年齡、吸煙史、高血壓史和糖尿病史分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

急性左心衰診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會心血管分會制定的《急性心力衰竭診斷和治療指南》[3]，NYHA分級III—IV級。常見臨床表現(xiàn)為呼吸困難，嚴(yán)重者出現(xiàn)進行性肺水腫和心源性休克。肺部感染根據(jù)X光常規(guī)胸片、血液學(xué)分析、痰液和血液細(xì)菌培養(yǎng)等結(jié)果確定。排除合并肺部以外感染及合并休克、出血患者；排除合并腎功能衰竭、肺栓塞、惡性腫瘤患者；排除合并內(nèi)分泌疾病患者。符合上述診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)的患者納入本研究，并簽署知情同意書。

表1 各組一般資料比較(各組總例數(shù)均為60)

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：DNA kit(批號：AS1290，Promega，美國)，Platinum TaqDNA聚合酶(批號：C10966-018，TaKaRa，日本)，Ager powder(批號：A8190，北京生物有限公司)，DNA Marker(批號：C18702，pEASY北京全金生物技術(shù)公司)，SYBR SAFE DNA GEL STAIN Biosystem(批號：S33102，上海天科生物有限公司)。實時定量PCR試劑盒(批號：480II，美國羅氏)。CRP檢測試劑盒(批號：96T/48T，上?？道噬锟萍加邢薰?。PCT檢測試劑盒(批號：kt99293，武漢默沙原生物科技有限公司)。

主要儀器：恒溫水浴箱(型號：HSW-600，上海永生醫(yī)療器械公司)，紫外線照相分析儀(型號：UV 2000，上海天能科技有限公司)。電化學(xué)免疫發(fā)光儀(型號：2010，美國羅氏)。全自動生化分析儀(型號：TBA-40FR，日本東芝)?；驍U增儀(型號：EDC-10，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。PCR儀(型號：T100，美國伯樂)?；驕y序儀(型號：PrFlexTM3×3.2-well，賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

所有患者均空腹8-12h，于入院次日清晨抽取肘靜脈血5ml，一部分置于EDTA抗凝管中，混勻進行NPPA基因檢測；其余置于帶分離膠促凝管中，分離血清，測定PCT、CRP水平。

1.3.1NPPA基因檢測：(1)DNA提?。貉簶颖窘?jīng)裂解、蛋白質(zhì)沉淀等步驟提取DNA，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)團塊出現(xiàn)后，離心5min吸取上清0.7ml，滴入異丙醇，混合后可見DNA沉淀物，離心5min后棄上清。滴入乙醇(70%)0.7ml，洗滌DNA沉淀物并晾干。滴入DNA溶解液60μl，65℃水浴30min，進行電泳，測定A260吸光光度值，測定DNA濃度，-20℃冰箱保存。(2) 引物設(shè)計：由南京金思特科技有限公司合成，引物序列見表2。(3)PCR擴增與測序：總反應(yīng)量25μl，包括PCR緩沖液(稀釋10倍)2.5μl，氯化鎂(50mmol/L)0.8μl，dNTP混合液(10mmol/L)0.5μl，上下游引物各1μl，DNA模板1μl，PlatinumTaq聚合酶0.2μl，雙蒸水18μl。將樣品混勻，置于PCR儀中進行擴增，完成擴增后吸取PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性(94℃，2min)，變性(95℃，30s)，退火(50℃，30s)，延伸(72℃，40s)，循環(huán)30次，4℃保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，并利用Sanger原理進行測序分析。 PCR擴增與測序由南京金思特科技有限公司完成。

表2 單核苷酸多態(tài)性位點引物序列

1.3.2PCT水平測定：采用電化學(xué)免疫發(fā)光法，使用電化學(xué)發(fā)光儀和配套試劑，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.3.3CRP水平測定：采用免疫散射比濁法，使用全自動生化分析儀和配套試劑，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組NPPA基因型分布比較

三組間NPPA的rs5063、rs5065之AA基因型、GG基因型分布均存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，而AG基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；左心衰組、左心衰感染組rs5063、rs5065的AA基因型患者比例明顯高于對照組(P<0.01)，GG基因型患者比例明顯低于對照組(P<0.01)。且病例組間rs5063、rs5065的AA、GG基因型患者比例無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。見表3。

表3 三組各60例患者NPPA基因多態(tài)性分布比較(n，%)

注：與對照組比較，1)P<0.01

2.2 急性左心衰合并肺部感染患者NPPA不同基因型PCT、CRP水平比較

左心衰感染組患者NPPA基因(rs5063、rs5065)的AA、AG、GG基因型患者血清PCT、CRP水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

3 討 論

急性心力衰竭是由于急性心臟變異導(dǎo)致的心排血量顯著降低，組織器官灌注不足，畸形體循環(huán)/肺循環(huán)瘀血綜合征，近年隨國人老齡化加快，其發(fā)病率急劇上升[4]。

NPPA基因是編碼心房利鈉肽前體的基因，定位于人染色體lp36.22，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子[5]，利鈉肽系統(tǒng)相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性與心血管疾病的相關(guān)關(guān)系已成為臨床研究的熱點。較多觀察業(yè)已證實，NPPA基因多態(tài)性與心力衰竭、原發(fā)性高血壓、中風(fēng)、房顫、心律失常等疾病的發(fā)生存在顯著相關(guān)性[6-8]。Mahmoodzadeh等[9]報道，rs5063和rs5065基因型與中風(fēng)的患病風(fēng)險有關(guān)；李文安等[10]認(rèn)為，NPPA作為急性左心衰非離子通道的致病基因，在急性左心衰的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。均表明NPPA基因是心血管疾病的致病基因。但有關(guān)NPPA基因多態(tài)性與急性左心衰及有否合并肺部感染的關(guān)系研究尚少。

表4 左心衰感染組患者NPPA不同基因型PCT、CRP水平比較

本研究結(jié)果表明，急性左心衰、急性左心衰伴肺部感染及無心衰/感染各組間NPPA基因(rs5063、rs5065)的AA、GG基因型患者比率存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異。急性左心衰患者的AA基因型的患者比率明顯高于對照組，GG基因型患者患者比率明顯低于對照組。說明NPPA基因多態(tài)性在急性左心衰患者中存在一定特異性。支持相關(guān)研究認(rèn)為NPPN基因多態(tài)性可在某種程度上決定心功能，成為急性左心衰的獨立危險因素之一[11]的結(jié)論。

進一步比較合并肺部感染患者與未合并感染患者間NPPA基因型的分布差異，結(jié)果顯示兩組患者rs5063、rs5065的AA、GA、GG基因型分布均無明顯差異；而且感染標(biāo)志物PCT和CRP水平的檢測結(jié)果也顯示兩組患者NPPA基因(rs5063、rs5065)的AA、AG、GG基因型患者之間亦無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。說明感染多為患者后天對感染源(細(xì)菌和病毒感染)的接觸所導(dǎo)致，并不具有基因型的特異性。

綜上所述，位于NPPA基因的單核苷酸rs5063、rs5065多態(tài)性在急性左心衰患者中存在特異性表現(xiàn)，這對于臨床上急性左心衰的診斷、治療具有一定的意義，對于研究藥物治療的靶點具有重大價值。