鄧文宏 易 斌 邱振東 項(xiàng)明偉 何小波 王衛(wèi)星

我國(guó)是結(jié)直腸癌高發(fā)國(guó)家，其發(fā)病率占我國(guó)惡性腫瘤第五位[1]，其中直腸癌占比可達(dá)70%[2]。盡管目前對(duì)直腸癌已展開多個(gè)層面的研究，但直腸癌具體的發(fā)病機(jī)制仍待進(jìn)一步明確。受體相互作用蛋白(Receptor Interacting Protein，RIP)是細(xì)胞增殖、死亡和機(jī)體固有免疫等過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。目前有研究表明，RIP與乳腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在多個(gè)腫瘤組織中均存在表達(dá)異常[3，4]，但是RIP與直腸癌的關(guān)系尚不十分明確。本研究檢測(cè)分析RIP1、RIP3在直腸癌組織中的表達(dá)情況，并初步評(píng)估其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組

隨機(jī)收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院普外科2015-01—2017-01間行直腸癌根治性切除術(shù)、病理檢查證實(shí)為直腸癌且病理及臨床資料齊備的患者40例，手術(shù)切除標(biāo)本后取少許病灶中心組織(直腸癌組)，所有病例術(shù)前均未接受放療或化療，其中男29例、女11例，中位年齡54歲(45-76歲)。腫瘤的原發(fā)灶大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況由患者病理學(xué)檢查結(jié)果及臨床資料確定，根據(jù)2017年NCCN制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。TNM分期Ⅰ-Ⅱ期18例，Ⅲ-Ⅳ期 22例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；組織分化程度：高、中分化24例，低、未分化16例；腫瘤直徑≥5cm 14例，<5cm 26例；脈管侵犯9例；神經(jīng)侵犯11例。另取手術(shù)切除非直腸癌患者正常黏膜20例作為對(duì)照組，其中男13例，女7例，中位年齡53歲(42-64歲)。 兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑

兔抗人RIP1、RIP3多克隆抗體購(gòu)自Abcom公司(批號(hào)：ab72139、ab56164)，鼠抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司(批號(hào)：BA1058)，SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)：D4418)。

1.3 組織樣本處理以及RIPI和RIP3蛋白測(cè)定

切除的新鮮直腸癌標(biāo)本立即予以4%中性甲醛固定，行石蠟包埋備用，其余大體標(biāo)本立即置10%福爾馬林固定送入病理科，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，由病理學(xué)專業(yè)醫(yī)師行病理學(xué)診斷。石蠟包埋樣本予以連續(xù)切片，每張切片厚約4μm，使用免疫組化SP法檢測(cè)，常規(guī)脫蠟，溫箱抗原修復(fù)，3%的H2O2復(fù)滅活內(nèi)源性蛋白酶10min，然后依次滴加一抗(1∶200稀釋)、二抗(1∶500稀釋)、鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1定性結(jié)果：組織切片用高倍鏡(×400) 檢測(cè)，以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。按染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。在鏡下對(duì)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞，共500個(gè)，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞<10%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞10%-50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞>50%為3分。染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分之和≥4分為免疫組化陽(yáng)性，否則記免疫組化陰性。

1.4.2定量結(jié)果：運(yùn)用ImagePro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化后圖片進(jìn)行分析，測(cè)量平均光密度值，其值越大，蛋白表達(dá)越多。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 直腸癌組織及正常組織中RIP1和RIP3的表達(dá)情況

RIP1在癌組織及正常組織均表達(dá)，RIP1存在于胞質(zhì)及胞膜中，在間質(zhì)不表達(dá)，為不均勻的棕黃色顆粒，呈無(wú)規(guī)律的散在分布。在癌組織中的表達(dá)弱于正常組織；RIP3陽(yáng)性染色無(wú)規(guī)律地散在分布于胞質(zhì)、胞核及胞膜中，在間質(zhì)中也有表達(dá)，其在癌組織中的表達(dá)低于正常組織。典型的表達(dá)情況如圖1、2所示。在直腸癌組織中，RIP1的陽(yáng)性表達(dá)率為65.00%(26/40)， RIP3陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%(24/40)，而在正常組織中RIP1的陽(yáng)性表達(dá)率為70.00% (14/20)，RIP3陽(yáng)性表達(dá)率為60.00%(12/20)，直腸癌組織與正常組織RIP1、RIP3的陽(yáng)性表達(dá)率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.228、0.053，P>0.05)。

圖1 RIP1在直腸癌組織及正常組織中的表達(dá)(SP，×400)

圖2 RIP3在直腸癌組織及正常組織中的表達(dá)(SP，×400)

2.2 RIP1、RIP3在直腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

低+未分化、Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯及神經(jīng)侵犯的直腸癌患者癌組織RIP1和RIP3的陽(yáng)性表達(dá)率高于高+中分化、Ⅰ-Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)脈管侵犯及無(wú)神經(jīng)侵犯患者(P<0.05)， RIP1和RIP3陽(yáng)性表達(dá)率在不同大小腫瘤中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 直腸癌組織中RIP1和RIP3表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 RIP1、RIP3在直腸癌組織和正常組織中表達(dá)量的比較

RIP1在直腸癌組織中的平均光密度值為0.211±0.282，低于正常組織中的平均光密度值(0.324±0.062)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.586，P<0.05)。RIP3在直腸癌組織中的平均光密度值為0.197±0.039，亦低于正常組織中的平均光密度值(0.288±0.042)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.458，P<0.05)。

3 討 論

正常細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)死亡，包括程序性壞死。細(xì)胞表面死亡受體(Fas)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)及I、II型干擾素(IFN)在內(nèi)的死亡受體激活后，信號(hào)通路下游形成RIP1和RIP3等蛋白構(gòu)成的壞死復(fù)合體，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死或細(xì)胞增殖。RIP1和RIP3均具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，具有很強(qiáng)的同源性，可通過(guò)與各自分子內(nèi)的同型相互作用基序(RIP Homotypic Interaction Motif, RHIM)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，形成β-淀粉樣的絲狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而相互磷酸化并參與壞死性凋亡、凋亡或NF-κB的激活[5]。

在血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤的研究中已經(jīng)證實(shí)了壞死性通路在癌癥生物學(xué)中的重要性。癌細(xì)胞類型和腫瘤微環(huán)境不同，程序性壞死對(duì)腫瘤進(jìn)展也會(huì)具有不同的影響。在部分急性髓性白血病的亞型中，RIP3的表達(dá)減少。一項(xiàng)臨床前研究顯示，RIP3可促進(jìn)轉(zhuǎn)化后祖細(xì)胞的死亡，死亡細(xì)胞釋放IL-1β，激活炎性小體，進(jìn)而促進(jìn)白血病起始細(xì)胞的分化，最終抑制急性髓性白血病中的惡性骨髓增生[6]。慢性胰腺炎是胰腺癌發(fā)展的最普遍的危險(xiǎn)因素，腫瘤發(fā)生總是伴隨著胰周炎性改變[7]。在人和小鼠胰腺癌細(xì)胞中，RIP1和RIP3表達(dá)均上調(diào)，在體外，阻斷壞死小體可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)侵襲性致癌表型，相反，小鼠體內(nèi)RIP3缺失或RIP1受抑制則可防止腫瘤進(jìn)展[8]，提示胰腺癌的進(jìn)展受腫瘤細(xì)胞自身和RIP1/RIP3相關(guān)的炎性環(huán)境影響[9]。此外，在黑色素瘤中RIP1表達(dá)通過(guò)NF-κB依賴性途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[10]。

本研究顯示， RIP1在直腸癌組織中呈低表達(dá)，其表達(dá)情況與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)，與其臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，而RIP3在直腸癌組織中呈低表達(dá)，其表達(dá)情況與患者的性別、年齡無(wú)關(guān)，與其臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，提示RIP1/RIP3在直腸癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。鑒于RIP1廣泛參與了細(xì)胞的存活、死亡及炎癥反應(yīng)過(guò)程[11]，RIP1/RIP3在直腸癌組織中的低表達(dá)可能有利于腫瘤的生長(zhǎng)及逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控。RIP1/RIP3的表達(dá)情況可能是判斷直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)潛在參考指標(biāo)。

在本研究中，RIP1/RIP3在直腸正常組織腺泡中的表達(dá)高于癌組織，但RIP1在間質(zhì)中無(wú)明顯表達(dá)， RIP3在組織間質(zhì)中存在表達(dá)，并見于間質(zhì)的淋巴細(xì)胞中，與RIP1形成明顯對(duì)比，提示RIP3與直腸癌的免疫反應(yīng)可能有關(guān)。其原因可能是正常組織中的RIP1和RIP3具有引起細(xì)胞程序性壞死的功能，而腫瘤細(xì)胞具有無(wú)限增殖的特性，會(huì)抑制RIP分子的表達(dá)。研究顯示，在胰腺癌中，程序性壞死通過(guò)CXC趨化因子配體1(Chemokine Ligand-1,CXCL1)的表達(dá)與免疫抑制和腫瘤發(fā)生相關(guān)。RIP3缺失可導(dǎo)致先天性和適應(yīng)性炎性介質(zhì)的免疫原性重編程，如腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞和Th1極化CD4+T細(xì)胞的增加，以及骨髓衍生抑制細(xì)胞(Myeloid Derived Suppressor Cells, MDSC)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的減少。此外，在RIP3缺失的情況下，抑制性巨噬細(xì)胞(促進(jìn)腫瘤發(fā)生)失去其免疫抑制效應(yīng)，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生具有強(qiáng)大抗腫瘤特性的免疫原性T細(xì)胞[8]。

綜上所述，RIP1和RIP3蛋白在直腸癌組織中均低表達(dá)，但RIP1/RIP3如何參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展及其對(duì)免疫反應(yīng)的影響的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。