劉欣菲 馬紅梅

阿霉素為蒽環(huán)類抗生素，是臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，主要適用于白血病、乳腺癌、淋巴瘤和肺癌等惡性腫瘤，療效顯著[1,2]。心臟毒性作用是阿霉素的主要副反應(yīng)之一，早期主要表現(xiàn)為心律不齊，如心動過速、QRS波群改變、非特異性ST-T改變和QT間期延長等，晚期則表現(xiàn)為擴張性心肌病和充血性心力衰竭[3,4]。因此，尋找有效的防治措施，對于改善患者預(yù)后和擴大阿霉素的臨床應(yīng)用意義深遠。

位于線粒體的絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2是胞內(nèi)線粒體凋亡途徑中重要的信號分子[5]，其特異抑制劑UCF-101對調(diào)控心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及神經(jīng)元的氧化應(yīng)激和凋亡等發(fā)揮著重要作用[6,7]。但目前尚不清楚UCF-101是否可以影響阿霉素介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡等，從而保護心肌功能。因此，本研究通過復(fù)制阿霉素致小鼠心臟毒性模型，觀察UCF-101對模型小鼠是否有心臟保護作用，為其臨床治療提供初步依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和藥品

60只SPF級雄性C57BL/6小鼠，體重25-30g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物房(22-24℃)，自由攝食、飲水。乳酸脫氫酶(LDH，批號：C0016)、肌酸激酶同工酶(CK-MB，批號：H197)、丙二醛(MDA，批號：S0131)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：S0103)和活性氧(ROS，批號：S0116)檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所(中國)。TUNEL試劑盒(批號：11684817910)購自Roche公司(德國)。阿霉素(批號：D1515)和UCF-101(UCF，批號：SML1105)均購自Sigam公司(美國)。

1.2 實驗分組及其處理

實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為4組，即空白對照組、UCF對照組、阿霉素模型組和阿霉素+UCF組，每組各15只。其中阿霉素模型組和阿霉素+UCF組小鼠一次性腹腔注射阿霉素15mg/kg復(fù)制阿霉素致心臟毒性模型[8]，兩組小鼠均成模?？瞻讓φ战M和UCF對照組小鼠一次性腹腔注射等量生理鹽水。之后，UCF對照組和阿霉素+UCF組小鼠分別每日腹腔注射UCF-101 1.5μmol/kg[8]，連續(xù)5天；空白對照組和阿霉素模型組則每日腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 超聲心動圖檢測心功能

于實驗第6天稱取小鼠體重后檢測心臟功能。各組小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射(40mg/kg)麻醉后固定在超聲操作臺上，采用Visual Sonics公司的小動物超聲儀(型號：Vevo770，加拿大)，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室短軸切面，測量并記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)及左心室短軸縮短率(FS)等心功能指標(biāo)。

1.4 血樣、心肌組織標(biāo)本采集、處理和分配

超聲檢測結(jié)束后取尾靜脈血液，每組成功獲取10只小鼠血樣，高速離心機(型號：Sorvall ST8，ThermoFisher Scientific公司)3 000g離心15min，收集血清直接測定酶學(xué)指標(biāo)LDH和CK-MB。頸椎脫臼法處死各組小鼠，取出心臟，擠出心臟殘血并稱取心臟質(zhì)量。每組10只小鼠心臟研磨成組織勻漿，BCA法測量總蛋白濃度后分別各5只用于測定心肌酶學(xué)指標(biāo)LDH、CK-MB和心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA和ROS水平；每組另5只小鼠心臟用4%中性福爾馬林固定后進行心肌細(xì)胞凋亡水平測定。

1.5 血清和心肌酶學(xué)指標(biāo)、心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

血清和組織勻漿酶學(xué)指標(biāo)以及組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)測定均采用ELISA，酶標(biāo)儀(型號：VarioskanFlash3001)購自ThermoFisher Scientific公司，操作步驟嚴(yán)格按照各指標(biāo)試劑盒說明書測定。

1.6 心肌細(xì)胞凋亡率測定

心肌組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后切片，滴加蛋白酶K進行抗原修復(fù)。將1μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)、1μl DIG-dUTP和18μl標(biāo)記緩沖液混勻后滴加于樣品玻片，室溫孵育2h。封閉后滴加一抗，室溫孵育2h，清洗后滴加二抗，避光孵育30min，每玻片加入50μl BCIP/NBT，孵育30min后漂洗，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。TUNEL陽性細(xì)胞呈棕褐色，高倍鏡(×400)下計數(shù)10個視野下細(xì)胞總數(shù)和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，取均值進行統(tǒng)計學(xué)分析。心肌細(xì)胞凋亡率=(陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組體重、心重和心功能指標(biāo)比較

各組間體重、心重、EF和FS差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；兩對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.15、0.44、0.90和0.78，P>0.05)；阿霉素模型組各指標(biāo)明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.09、6.52、15.52和18.13,P<0.01)；阿霉素+UCF組小鼠各指標(biāo)顯著高于阿霉素模型組(t=4.99、3.62、20.51和5.25，P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠體重、心重和心功能指標(biāo)比較均=15)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01；與阿霉素模型組比較，2)P<0.01

2.2 各組血清和心肌組織酶學(xué)指標(biāo)比較

各組間血清和心肌組織LDH和CK-MB水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩對照組比較，血清和心肌LDH和CK-MB水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.63、2.06、1.58和0.89，P>0.05)；阿霉素模型組血清和心肌組織LDH和CK-MB水平均明顯高于空白對照組(t=52.02、18.31、23.57和14.96，P<0.01)；阿霉素+UCF組小鼠血清和心肌LDH和CK-MB水平均明顯低于阿霉素模型組(t=33.60、15.04、11.18和5.38，P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠血清和心肌酶學(xué)指標(biāo)比較

注：與空白對照組比較，1)P<0.01；與阿霉素模型組比較，2)P<0.01

2.3 各組心肌氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

各組間心肌組織SOD、MDA和ROS水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩對照組比較，以上指標(biāo)無明顯差異(t=1.549、1.000和1.150，P>0.05)；阿霉素模型組SOD水平明顯低于空白對照組，MDA和ROS水平明顯高于空白對照組(t=17.58、25.43和11.17，P<0.01)；阿霉素+UCF組SOD水平較阿霉素模型組顯著升高，MDA和ROS水平較阿霉素模型組顯著降低(t=10.55、17.99和9.164，P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平比較

注：與空白對照組比較，1)P<0.01；與阿霉素模型組比較，2)P<0.01

2.4 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

各組間心肌細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩對照組心肌細(xì)胞凋亡率比較無明顯差異(t=2.00，P>0.05)。阿霉素模型組凋亡率明顯高于空白對照組(t=28.86，P<0.01)；阿霉素+UCF組凋亡率明顯低于阿霉素模型組(t=17.94，P<0.01)。見圖1和表4。

表4 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率均=5)

注：與空白對照組比較，1)P<0.01；與阿霉素模型組比較，2)P<0.01

注：阿霉素模型組凋亡細(xì)胞(棕褐色)多于對照組，而阿霉素+UCF組凋亡細(xì)胞則較阿霉素模型組明顯減少

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平(×400)

3 討 論

既往研究表明，當(dāng)阿霉素累積量從400mg/m2到超過700mg/m2時，心力衰竭的發(fā)生率從5%上升為48%[9]，但此心臟毒性的具體機制尚未全面明確。目前較公知公認(rèn)的機制為脂質(zhì)過氧化和線粒體功能損傷，認(rèn)為阿霉素進入心肌細(xì)胞后，可被線粒體細(xì)胞色素P450還原酶和NADPH氧化還原酶還原為半醌自由基，直接作用于心肌細(xì)胞，引起線粒體和DNA損傷[10，12]。而且半醌自由基還可將電子傳遞給氧和水，產(chǎn)生大量ROS，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白過氧化，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13，14]。因而從阿霉素致病機制中尋找抵抗或改善其毒性作用的靶點，如Omi/HtrA2等，成為臨床關(guān)注的重點。

UCF-101是特異性的Omi/HtrA2抑制劑，可通過抑制Omi/HtrA2活性和胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，調(diào)控心肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等的凋亡過程[15]。相關(guān)研究表明，UCF-101可通過抑制Omi/HtrA2活性，降低心肌缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞凋亡[16]，以及 UCF-101可通過降低胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善膿毒癥大鼠腦氧化損傷和認(rèn)知反應(yīng)[9]。但有關(guān)UCF-101能否針對Omi/HtrA2靶點改善阿霉素介導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，保護心功能的報道甚少。

本實驗通過建立小鼠阿霉素致心臟毒性模型，觀察UCF-101在阿霉素致心臟毒性中的作用。結(jié)果顯示阿霉素模型組小鼠體重、心重和心功能指標(biāo)EF、FS均明顯降低，心功能受損。UCF-101連續(xù)干預(yù)5天可顯著改善模型小鼠心臟狀況和心功能，繼續(xù)觀察心肌酶學(xué)指標(biāo)LDH、CK-MB和氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA和ROS以及心肌細(xì)胞凋亡率，均發(fā)現(xiàn)UCF-101干預(yù)可以顯著降低LDH、CK-MB水平，顯著降低MDA、ROS活性和心肌細(xì)胞凋亡率，提升SOD水平，實現(xiàn)改善心臟損傷、改善心功能的目標(biāo)。其作用主要由于SOD作為體內(nèi)重要抗氧化劑，可以清除過多ROS和MDA，使由半醌自由基與氧結(jié)合形成的ROS及其對心肌細(xì)胞膜完整性的破壞減少，使脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的醛類物質(zhì)MDA減少，加上酶促反應(yīng)水平的降低，從而有效下調(diào)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，有效保護心肌細(xì)胞凋亡，極大地改善心臟功能。

總之，UCF-101能有效緩解阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，改善心臟功能，發(fā)揮心臟保護作用，為以線粒體蛋白酶Omi/HtrA2作為靶點防治阿霉素致心臟毒性提供了新思路。