陳小奇 徐焱成 劉勝武 陳 敏 萬茜茜

1型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM)是自身免疫反應參與的以胰島β細胞損害為特征的疾病，多種免疫細胞參與了疾病的發(fā)生過程。CD4+T細胞在促進胰島細胞免疫損傷、加重疾病進展過程中起主導作用。Th17細胞是CD4+T細胞亞型，有研究表明T1DM患者外周血Th17細胞升高，通過分泌白細胞介素-17A (IL-17A)發(fā)揮免疫炎癥效應,與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關[1-4]。 除了T細胞，B淋巴細胞也可以通過抗原提呈、分泌自身抗體及細胞因子如B細胞活化因子(BAFF)等參與多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程[5]。但T、B淋巴細胞及其相關因子在自身免疫性疾病包括T1DM的表現(xiàn)和相互作用的研究報道較為少見。本文檢測分析T1DM模型大鼠血清和脾臟組織中IL-17A和BAFF等的水平變化，初步了解Th17細胞與B細胞對T1DM發(fā)生的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組處理

雄性SPF級成年健康SD雄性大鼠15只，質(zhì)量180g-200g，購于武漢大學A3動物實驗室，在本院實驗動物中心分籠適應性飼養(yǎng)3天后，隨機分為三組：(1)1型糖尿病大鼠組(T1DM組，n=5)： 采用基礎飼料(蛋白質(zhì)21%，脂肪6%，碳水化合物55%)喂養(yǎng)5周后，連續(xù)5天低劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,美國sigma公司產(chǎn)品，濃度0.4%，40mg/kg/天)進行自身免疫誘導。每周剪尾取血，應用拜安易血糖儀(德國拜耳，氧化酶法)檢測血糖濃度，以高于16.67mmol/L為成模標準[6]。(2)2型糖尿病大鼠組(T2DM組，n=5)：先以高脂飼料(能量比為:蛋白質(zhì)15%、碳水化合物33%、脂肪52%)喂養(yǎng)5周后，按上述方法注射低劑量STZ一次，此后連續(xù)4天亦腹腔注射等量生理鹽水，72h后按上法取血和測量血糖濃度，亦以高于16.67mmol/L為成模標準[7]。兩組大鼠均全部成模。(3)另5只大鼠為正常對照組(CON組)：以基礎飼料喂養(yǎng)5周后，連續(xù)5天腹腔注射與上述制模大鼠等量生理鹽水。最后將三組大鼠于SPF環(huán)境喂養(yǎng)，自由飲水攝食,并行空腹稱重、測血糖(FBG)，取內(nèi)眥靜脈血，測定C肽(FCP)、IL-17A和BAFF濃度。采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，迅速摘取脾臟，檢測脾組織IL-17A、BAFF蛋白表達和抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平。

1.2 檢測指標和方法

1.2.1FBG和FCP水平檢測:FBG檢測方法如上。FCP檢測：取大鼠內(nèi)眥靜脈血于非抗凝劑管內(nèi),室溫下2 000r/min ×5min分離血清,采用放射免疫法(試劑盒購自中國原子能科學研究院)檢測，步驟嚴格按照說明書，根據(jù)γ放射免疫計數(shù)器(中國科大中佳公司)給出的相關參數(shù)和標準曲線，得到樣品濃度。

1.2.2血清IL-17A和BAFF檢測：采用ELISA，試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品，按要求在酶標板上分別加入標準品和樣品(樣品制備方法同F(xiàn)CP)，加入生物素標記液，37°C孵育1h、洗板后加入終止液，30°C暗盒反應20min，在酶標儀450nm波長讀數(shù)，采用CurveExpert 1. 3軟件給出的標準曲線和公式，計算待測樣品中IL17A和BAFF濃度。

1.2.3脾臟IL-17A和BAFF蛋白表達：采用Western blot法，IL-17A抗體和BAFF抗體分別購自美國SANT CRUZ和英國ABCAM公司。脾組織裂解后離心取上清置于離心管用于電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育后，將印跡膜與發(fā)光底物工作液孵育1-5min，在暗室中曝光膠片，立即顯影、定影，使用Bandscan軟件分析樣品和內(nèi)參灰度值，并計算灰度比值(OD)，用以反映蛋白表達水平。

1.2.4脾臟Bcl-2基因表達： 采用實時熒光定量PCR。取脾臟組織100mg，Trizol一步法提取RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo公司)合成cDNA模板，反應體系20μl，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，三磷酸脫氧核苷酸混合溶液2μl，類似引物1μl，無RNA酶的水1μl，RNA酶抑制劑1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNA 10μl。反應條件為42℃ 逆轉(zhuǎn)錄20 min，95℃ 滅活5min，4℃冷卻5min。在基因庫中檢索大鼠Bcl-2基因序列，采用Premier 5.0軟件設計并選擇最佳的引物如下，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：Blc-2 F：ACG GTG GTG GAG GAA C；Blc-2 R：CAG CCA GGA GAA ATC AAA。β-actin內(nèi)參引物序列為：β-actin F：CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC；β-actin R：TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC。

檢測Bcl-2 mRNA：反應體系由滅菌水4μl，SYBR Green Realtime PCR Master Mix (日本Toyobo公司)10μl，上游引物(10μM)0.8μl，下游引物(10μM)0.8μl，模板RNA 1μl組成。PCR反應條件: 95℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 45s，40個循環(huán)。實時PCR產(chǎn)物從72℃緩慢而均勻地升至95℃，溫度每升高0.2℃讀一次熒光值，循環(huán)閾值(Ct)的設置為3-15個循環(huán)熒光信號強度標準偏差的10倍。循環(huán)結(jié)束后在SLAN軟件系統(tǒng)自動繪制擴增動力曲線。由SLAN熒光定量分析軟件自動繪制熔解曲線，通過熔解曲線分析反應產(chǎn)物的純度以判斷實驗的特異性。調(diào)整基線和閾值，讀出各反應孔Ct值?；虮磉_水平差異的比較用變化倍率表示。變化倍率=2-△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-(Ct陰性對照-Ct內(nèi)參基因)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組間FBG、FCP和BW比較

三組間FBG、FCP和BW存在顯著差異(P<0.01)。兩兩比較T1DM組和T2DM組FBG顯著高于CON組(P<0.01)，且T1DM組高于T2DM組(P<0. 05)；T1DM組FCP顯著低于CON組和T2DM組，T2DM組FCP高于CON組(均P<0.01)；T1DM組和T2DM組大鼠BW均低于CON組(P<0. 01)，T1DM組更輕(P<0.01)。見表1。

表1 三組大鼠FBG、FCP和BW比較均=5)

注：與CON相比，1)P<0.01;與T2DM組相比,2)P<0.01

2.2 各組間血清IL-17A和BAFF水平比較

三組間血清IL-17A 水平有顯著性差異(P<0.01)。T1DM組和T2DM組均顯著高于CON組(t=-5.10，P<0.01 ，t=3.11，P<0.05)，且T1DM組顯著高于T2DM組(t=-3.03，P<0.01)。三組間血清BAFF水平亦有顯著性差異(P<0.01)。T1DM組和T2DM組均顯著高于CON組(t=-13.05，P<0.01；t=-5.54，P<0.01)，T1DM組顯著高于T2DM組(t=5.79，P<0.01)。見表2。

表2 三組間血清IL-17A 和BAFF比較均=5)

注：與CON組相比，1)P<0.01;與T2DM組相比,2)P<0.01

注：與CON組比較， * P<0.01;與T2DM組比較，# P<0.01

2.3 各組間脾組織IL-17A蛋白和BAFF蛋白水平比較

三組間脾組織IL-17A和BAFF蛋白水平與其血清水平的變化趨勢一致，其蛋白電泳條帶見圖1A。兩指標的三組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=66.03、33.87,P<0.01)。IL-17A在T1DM組(2.03±0.09)和T2DM組(1.40±0.07)顯著高于CON組(0.99±0.11)(t=-10.76、-4.49,P<0.01)，且T1DM組明顯高于T2DM組(t=-6.27，P<0.01)，見圖1B。BAFF在T1DM組(2.41±0.06)

和T2DM組(1.67±0.06)均顯著高于CON組(1.00±0.12)(t=-20.26、-5.87，P<0.01)，且T1DM組顯著高于T2DM組(t=-5.87，P<0.01)，見圖1C。

2.4 各組間脾組織Bcl-2 mRNA水平比較

三組大鼠間脾組織 Bcl-2 mRNA表達水平有顯著差異(F=17.10,P<0.01)。T1DM組(17.57±0.70)和T2DM組(11.68±3.27)顯著高于CON組(8.18±1.15)(t=-6.83、-4.74，P<0.01)，且T1DM組高于T2DM組(t=3.94，P<0.05)。見圖2。

注：與CON組比較，* P<0.01;與T2DM組比較，# P<0.01

3 討 論

BAFF是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，是由炎性細胞分泌、維持B細胞免疫平衡的關鍵因素。通過促進B細胞的分化、增殖和存活、輔助自身反應性B細胞的選擇及類型轉(zhuǎn)換，參與自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展[8,9]。BAFF與其受體結(jié)合可促進Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮減少B細胞凋亡效應。Bcl-2基因高表達有利于增加B細胞存活和擴增，加重免疫反應[10]。

IL-17A是Th17細胞分泌的特異細胞因子和主要的效應分子，也是Th17細胞的重要分子標志。Th17細胞通過IL-17A參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生[4,11-14]，是多種自身免疫性疾病的主要效應細胞。盡管Th17細胞在T1DM發(fā)生中的作用已經(jīng)被認識[2,15]，但具體機制并不清楚。T1DM免疫損傷是由多種細胞因子及免疫細胞參與的免疫網(wǎng)絡綜合作用的結(jié)果, 新近文獻報道IL-17和γ干擾素(IFN-γ) 、IL-12 可能促進T1DM的自身免疫反應和β細胞損傷，而IL-4、IL-6和IL-13水平下調(diào)對疾病有預防作用[16]。

脾臟是成熟T、B淋巴細胞的定居場所和自身免疫反應的主要參與者，也是免疫干預的重要靶器官[17]。脾臟組織細胞炎性分子表達的研究對于闡明免疫反應的發(fā)生機制具有更好的指導作用。

本研究檢測STZ誘導的T1DM大鼠IL-17A、BAFF在外周血和脾臟表達水平，以及BAFF下游的Bcl-2基因在脾臟的表達，結(jié)果顯示正常大鼠外周血IL-17A和BAFF水平極低，而T1DM和T2DM大鼠兩指標水平均明顯升高，以T1DM大鼠升高最為顯著。三組大鼠脾臟組織中IL-17A和BAFF蛋白表達結(jié)果亦顯示，T1DM組兩指標表達水平均顯著高于CON組和T2DM組，與外周血表現(xiàn)一致。提示IL-17A和BAFF均與T1DM發(fā)生、發(fā)展有關，通過血清濃度變化與脾組織蛋白表達趨勢一致，提示可以將二者作為疾病免疫炎癥監(jiān)測的生物標志。在T2DM大鼠也可以看到BAFF和IL-17A水平的升高，但顯著低于T1DM組，提示低滴度炎癥反應在T2DM的發(fā)病過程中具有重要作用，與文獻報道結(jié)果一致[18]。進一步研究脾臟Bcl-2基因表達時發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 mRNA水平在T1DM大鼠的脾臟也顯著高于CON組和T2DM組，Bcl-2受BAFF調(diào)節(jié)，促進B淋巴細胞存活和增殖[19], Bcl-2高表達為B細胞參與T1DM發(fā)生提供了有力的佐證。

對于IL-17A和BAFF在參與T1DM發(fā)生時，二者是否存在相互作用尚待進一步研究。以往有報道IL-17A和BAFF協(xié)同參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展[20]。近期又發(fā)現(xiàn)BAFF和Th17細胞在斑禿的發(fā)病中具有協(xié)同作用[21]。在慢性胃炎中，幽門螺旋桿菌感染誘導巨噬細胞分泌的BAFF可刺激Th17細胞反應[22]。另外，在T1DM的發(fā)生過程中，BAFF能否通過Bcl-2促進Th17細胞存活，進而增加IL-17的分泌亦待進一步研究證實。

總之，T1DM的發(fā)生與IL-17A和BAFF有關，BAFF可能通過Bcl-2促進自身和B淋巴細胞的活化，參與T1DM的發(fā)生。對于B淋巴細胞和Th17細胞在T1DM發(fā)生中的相互作用及其免疫損傷機制尚需進一步研究論證。