張 堅(jiān) 楊明峰 劉明明 李 媛 孫保亮, #

樟柳堿是從茄科植物唐古特山莨菪根中提取的一種生物堿，為膽堿能神經(jīng)阻滯劑，具有緩解平滑肌痙攣的抗膽堿作用，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成，其對(duì)恢復(fù)微循環(huán)灌注、改善局部組織缺血、提升微血管活性、緩解微血管痙攣、保護(hù)和穩(wěn)定微血管內(nèi)皮細(xì)胞等方面的功效明確[1]。復(fù)方樟柳堿(Compound Anisodine，CA)為氫溴酸樟柳堿(703)和普魯卡因(PHI)的復(fù)合制劑，可改善多種原因所致的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和視神經(jīng)部位的微循環(huán)血液灌注障礙，有助于治療青光眼視神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞和視神經(jīng)挫傷等疾病，已廣泛應(yīng)用于治療缺血性眼病，其功效機(jī)理以改善缺血組織微循環(huán)血流灌注為基礎(chǔ)[2-4]，達(dá)到比單純擴(kuò)血管藥物更佳的療效[5]，但改善血流灌注的作用機(jī)制尚未闡明。

微血管自律運(yùn)動(dòng)是微血管持續(xù)呈現(xiàn)的自主節(jié)律性收縮與舒張，并由此引起局部微循環(huán)血流灌注的節(jié)律性波動(dòng)，有助于促進(jìn)微循環(huán)灌注效率、促進(jìn)物質(zhì)交換與代謝，具有重要生理意義[6-9]。組織缺血初期微血管自律運(yùn)動(dòng)激活可代償性增加組織微循環(huán)灌注能力[10]，若缺血狀態(tài)持續(xù)，自律運(yùn)動(dòng)會(huì)受到抑制，組織缺血可能進(jìn)一步加重。應(yīng)用莨菪類(lèi)藥物可以激活微血管自律運(yùn)動(dòng)，改善組織微循環(huán)血流灌注狀態(tài)[11]。因此，激活微血管自律運(yùn)動(dòng)對(duì)加強(qiáng)組織微循環(huán)血流灌注、改善組織缺血狀態(tài)意義顯著。本研究通過(guò)活體動(dòng)物微動(dòng)脈反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討CA及其組分703(0.01%)和PHI(0.1%)對(duì)大鼠小腸壁微動(dòng)脈血流灌注和自律運(yùn)動(dòng)的影響，為CA臨床作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量233.2±19.2g，共66只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXX [京] 2012-0001，批號(hào)：1140070094792)。經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)時(shí)所用藥物，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為CA組、703組和PHI組，每組18只，余12只用作生理鹽水(NS)對(duì)照組(NS組)。各組大鼠飼養(yǎng)于12h明暗交替環(huán)境，溫度22-23℃，濕度40%- 60%，自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1試劑：重酒石酸去甲腎上腺素(NE)注射液購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司(規(guī)格2mg/ml，批號(hào)：131003)，配制應(yīng)用濃度為0.02%；CA注射液購(gòu)自北京紫竹藥業(yè)有限公司(規(guī)格2ml，含703 0.2mg、pHI 20mg，批號(hào)：14130906)，應(yīng)用濃度為注射液原液；703粉劑購(gòu)自北京紫竹藥業(yè)有限公司(批號(hào)：1420140303)，配制應(yīng)用濃度為0.01%；PHI注射液購(gòu)自東亞制藥有限公司(規(guī)格0.1ml，濃度1%，批號(hào)：2014091761)，配制應(yīng)用濃度為0.1%；NS購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司，使用濃度為0.9%。所有試劑配制均使用雙蒸水。

1.2.2儀器：Nikon體視顯微鏡(AZ100型，日本Nikon公司)；三維可調(diào)節(jié)光纖冷光源照明裝置(C-FLED2型，日本Nikon公司)；激光多普勒微循環(huán)血流儀(LDF PF5000型，光纖探頭200μm，瑞典Perimed公司)；自動(dòng)微量注射泵(KDS-100-CE型，美國(guó)KD Scientific公司)；PVC輸液管(200μm)與光纖探頭組合為一體，安裝于三維可調(diào)節(jié)夾持裝置，確保滴液定位準(zhǔn)確；自制小腸保濕恒溫裝置。

1.3 大鼠小腸壁微動(dòng)脈顯微觀(guān)測(cè)方法

各組大鼠經(jīng)3 %戊巴比妥鈉麻醉后，于下腹部中線(xiàn)右側(cè)切口，暴露小腸段，置于保濕恒溫實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)，在體視顯微鏡下通過(guò)三維調(diào)節(jié)夾持裝置將LDF光纖探頭和PVC輸液管組合垂直定位于小腸外壁單支微動(dòng)脈(平均管徑95±21μm)，保證給藥、檢測(cè)的精準(zhǔn)定位控制。

所有藥物通過(guò)輸液泵滴加單支微動(dòng)脈，滴加量均為0.1ml，藥物影響范圍≤5mm2。先行滴加NE 0.1ml致微動(dòng)脈完全收縮，隨后立即滴加各種干預(yù)藥物。連續(xù)記錄NE前、各種藥物干預(yù)后即刻至15min的微動(dòng)脈血流灌注和自律運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)曲線(xiàn)，選擇讀取NE前、藥后即刻、1min、5min、10min、15min 6個(gè)時(shí)點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

將各組NE前平穩(wěn)時(shí)10s血流量均值設(shè)為均一化基準(zhǔn)值，觀(guān)察記錄各組各時(shí)點(diǎn)微動(dòng)脈血流灌注和自律運(yùn)動(dòng)的變化水平。其中血流灌注指標(biāo)包括血流灌注水平(BP)、相對(duì)血流灌注水平[RBP=(藥后不同時(shí)點(diǎn)BP/NE前BP基準(zhǔn)值)×100]；自律運(yùn)動(dòng)指標(biāo)包括藥后自律運(yùn)動(dòng)起始時(shí)間(Vt)，應(yīng)用快速傅里葉變換法(FFT)[12]計(jì)算藥后15min內(nèi)微動(dòng)脈自律運(yùn)動(dòng)頻率(VF)和振幅(VA)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠微動(dòng)脈RBP比較

應(yīng)用NE預(yù)收縮前，各組BP的基線(xiàn)值未見(jiàn)明顯差別(P>0.05)；滴加NE后，各組微動(dòng)脈血流均停滯。局部滴加不同實(shí)驗(yàn)藥物后不同時(shí)間，各組BP開(kāi)始不同程度恢復(fù)，如圖1所示。據(jù)此計(jì)算分析各組藥后RBP時(shí)效，結(jié)果表明藥后即刻、1min、5min、15min的RBP水平經(jīng)方差分析有顯著性差異(均P<0.05)，各組藥后10min的RBP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩兩比較，藥后即刻RBP以703組最高，與NS組接近(P>0.05)，PHI組最低；藥后1min和5min的RBP以CA組最高，幾近NE前水平(P>0.05)，顯著高于其它三組(均P<0.01)，PHI組次之，也明顯高于703組和NS組(均P<0.01)；藥后15min的RBP仍以CA組最高，與其它三組有顯著差異(均P<0.05)，703組次之，PHI組最低。見(jiàn)表1和圖2。

2.2 各組大鼠微血管自律運(yùn)動(dòng)指標(biāo)比較

應(yīng)用NE可致微動(dòng)脈預(yù)收縮，造成局部微循環(huán)停滯，但伴行的微靜脈未見(jiàn)同步收縮反應(yīng)。給予實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)，在微血流恢復(fù)中，藥物作用可誘發(fā)檢測(cè)點(diǎn)原位或其上游微動(dòng)脈出現(xiàn)不同程度的自律運(yùn)動(dòng)，引起檢測(cè)點(diǎn)微血流灌注量節(jié)律性波動(dòng)。

圖1 各組大鼠微動(dòng)脈藥物干預(yù)前后BP變化曲線(xiàn)

組 別nNE前藥后即刻藥后1min藥后5min藥后10min藥后15minNS組12100.00±0.0017.37±5.1617.37±4.2426.37±10.5664.64±28.5078.80±24.89CA組18100.00±0.0015.15±3.711)71.89±20.632)96.60±19.672)85.36±22.4191.50±18.541)703組18100.00±0.0018.33±5.253)21.74±6.653)24.95±7.843)82.02±19.9283.65±21.153)PHI組18100.00±0.0011.23±2.104)44.15±18.214)78.34±19.814)76.02±20.3565.97±23.844)F值8.8937.7061.571.573.32

注：與703組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與PHI組比較，3)P<0.01；與NS組比較，4)P<0.01

圖2 各組大鼠微動(dòng)脈藥物干預(yù)前后RBP的時(shí)效曲線(xiàn)

如表2所示，各組間數(shù)據(jù)方差分析VF無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，Vt和VA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。兩兩比較703組Vt出現(xiàn)最早，CA組次之，均明顯早于PHI組和NS組(P<0.05或P<0.01)；CA組VA顯著高于其它三組(P<0.01)，PHI組大于703組和NS組(均P<0.01)，703組與NS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組微動(dòng)脈自律運(yùn)動(dòng)指標(biāo)比較

注：與703組比較，1)P<0.05，2)P<0.01；與PHI組比較，3)P<0.01；與NS組比較，4)P<0.01

3 討 論

既往研究表明，山莨菪堿能夠激活微血管自律運(yùn)動(dòng)[11]，改善組織血流灌注。本研究顯示，CA可使大鼠微動(dòng)脈相對(duì)血流灌注水平回升至NE前，明顯強(qiáng)于其組分703和PHI的單獨(dú)作用。提示CA對(duì)于NE所致微動(dòng)脈收縮，有快速擴(kuò)張微動(dòng)脈恢復(fù)血流灌注的功效。

微血管自律運(yùn)動(dòng)是微循環(huán)血流灌注調(diào)控的動(dòng)態(tài)模式，由小動(dòng)脈、微動(dòng)脈和毛細(xì)血管前括約肌等的自主節(jié)律性舒縮，并引起組織微循環(huán)血流及壓力的節(jié)律性波動(dòng)而成，可使毛細(xì)血管床血液充盈和排空呈現(xiàn)交替變化[7]，有助于提高組織血流灌注水平，促進(jìn)微循環(huán)物質(zhì)交換和氧代謝[7, 13, 14]。自律運(yùn)動(dòng)根據(jù)其頻率和振幅可分為三種基本有效模式，即低頻高幅、高頻高幅、高頻低幅，其中低頻高幅模式能效最大、持久性最強(qiáng)，對(duì)血流灌注和物質(zhì)交換貢獻(xiàn)最顯著[15, 16]，而低頻低幅模式屬于無(wú)效噪音模式。本文顯示，VF各組間無(wú)顯著差異，均為低頻模式；CA組Vt較早，VA最高，符合低頻高幅模式的微血管自律運(yùn)動(dòng)，可快速激活微動(dòng)脈，快速提升微循環(huán)血流灌注水平；703組的Vt雖早于CA組，但其VA很低，相對(duì)CA組，可認(rèn)為其微血管自律運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)為低幅模式，對(duì)改善血流灌注貢獻(xiàn)明顯不如CA；PHI組Vt較慢，VA雖相對(duì)較高，但明顯低于CA組，有較強(qiáng)的擴(kuò)血管、增血流效果，但無(wú)法形成穩(wěn)定高效的微血管自律運(yùn)動(dòng)，因此改善組織微循環(huán)灌注的能力有限；NS組為低頻低幅模式，且Vt也晚，故對(duì)血流灌注的改善幾乎無(wú)作用。說(shuō)明CA可發(fā)揮703和PHI的協(xié)同作用，激活微血管自律運(yùn)動(dòng)低頻高幅模式，產(chǎn)生高效改善組織缺血的效果，充分體現(xiàn)了CA的優(yōu)越性。

微血管自律運(yùn)動(dòng)受神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，與組織代謝狀態(tài)和組織血氧變化密切相關(guān)[17, 18]。自律運(yùn)動(dòng)的波浪樣節(jié)奏，較穩(wěn)態(tài)血流更能顯著提高毛細(xì)血管床的血流灌注和跨血管壁物質(zhì)交換的效率，增強(qiáng)組織氧代謝和氧擴(kuò)散距離以及促進(jìn)氧濃度均勻分布，這種特殊的血流動(dòng)能還有助于防止血栓形成、減少白細(xì)胞貼壁，改善微循環(huán)血流狀態(tài)、緩解局部血流瘀滯[19, 20]，解除血管痙攣，改善血液黏稠度[5]，從而更有效提升血流動(dòng)能和灌注效率。

綜上，CA能明顯改善NE致大鼠腸壁微動(dòng)脈缺血，干預(yù)機(jī)理在于其激活了微動(dòng)脈自律運(yùn)動(dòng)的低頻高幅模式。CA的組方配伍，在發(fā)揮PHI解痙和擴(kuò)血管作用的同時(shí)，利用703激活微血管自律運(yùn)動(dòng)功效，協(xié)同改善組織血流灌注和微循環(huán)功能。本研究為全面闡明臨床實(shí)踐中CA的治療作用提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。