李越　王自強　王云山　張萬忠　蘇志國

摘要：以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基對植物乳桿菌的發(fā)酵液進行回用實驗，采用搖瓶與7L發(fā)酵罐對發(fā)酵工藝過程中各階段活菌數(shù)與乳酸的濃度變化進行了初步研究。在搖瓶階段對植物乳桿菌與乳酸聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵的可行性進行驗證，并在7L發(fā)酵罐上進行應用性嘗試。研究結(jié)果表明：通過回用植物乳桿菌的發(fā)酵液能夠使乳酸最終產(chǎn)量達到150g/L。在7L發(fā)酵罐規(guī)模下，發(fā)酵終點活菌數(shù)累積量達到259×108CFU/ml

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌;乳酸;聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵;廢液回用

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬乳桿菌屬，屬于同型發(fā)酵乳酸菌，是目前最常用的益生菌之一。廣泛應用于青貯飼料的制作與益生菌劑的生產(chǎn)中，并且取得了良好效果【1-3】。隨著人們研究的不斷深入，植物乳桿菌已成為乳酸菌研究領(lǐng)域的模式菌種，并有人將其形象地稱為“自然代謝工程師”【4】。在植物乳桿菌發(fā)酵過程中能夠利用糖類發(fā)酵生產(chǎn)乳酸細菌【5】，乳酸作為21世紀最具應用潛力的有機酸之一【6】。廣泛應用于食品行業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)，同時乳酸還可作為防腐劑、酸味劑等應用于其他行業(yè)【7-8】。在乳酸生產(chǎn)方面，呂樂等【9】人通過改變?nèi)樗峋l(fā)酵條件篩選出—株高產(chǎn)乳酸的乳酸菌USTB-08，通過pH值控制得到了最高的乳酸產(chǎn)量為30g/L。

植物乳桿菌用于益生菌劑生產(chǎn)時，主要采用分批發(fā)酵方式。發(fā)酵培養(yǎng)基中K+和Mg2+這些無機元素在發(fā)酵過程中主要起到調(diào)節(jié)細胞滲透壓、作為酶的組成成分或維持酶的活性等作用【10】，只有極少部分被菌體吸收，大量地將發(fā)酵液排放至大自然中，不僅浪費，還會造成環(huán)境的污染。而植物乳桿菌代謝過程中會產(chǎn)生一定濃度的乳酸【11】，隨著發(fā)酵液回用次數(shù)的增加，乳酸產(chǎn)量也在不斷增加。因此，本研究期望對植物乳桿菌發(fā)酵液的回用來減少廢水排放，并達到節(jié)能環(huán)保的目的，且在一定程度上降低了生產(chǎn)成本。同時實現(xiàn)植物乳桿菌與乳酸的高密度聯(lián)產(chǎn)，為其他益生菌發(fā)酵提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1 1 1實驗試劑植物乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）由本實驗室保藏;玉米漿、酵母粉由山東鄒平鶴伴山生物科技有限公司提供;磷酸氫二甲，硫酸鎂，硫酸錳，檸檬酸銨、葡萄糖、氨水、濃硫酸由北京北化精細化學品公司提供。

1 1 2實驗儀器Bio- Rad譜柱：美國Beckman公司;Sartorius ar-ium 611UF型純水機：德國Sartorius公司;7200型分光光度計：上海尤尼克公司;2695型HPLC：美國Waters公司;DELTA320pH計、電子天平：METTLER TOLEDO：LDZX-4081立式蒸汽壓力滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠;SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱：黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司;XL-90型大容量離心機：美國Beckman公司;5L全自動攪拌式發(fā)酵罐：上海百侖生物科技有限公司;高效液相色譜LC-20AT：日本島津公司。

1.1 3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基（ MRS）【12】：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母粉lOg/L，磷酸氫二甲2g/L，無水乙酸鈉5g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.05g/L，檸檬酸銨2g/L，吐溫80lml/L，調(diào)pH至6.5 - 6.8，于121。C滅菌30min。

發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖20，玉米漿30，酵母粉5，磷酸氫二甲2，硫酸鎂0 2，硫酸錳0 05，檸檬酸銨2，調(diào)pH值至6.5 -6.8，于1210C滅菌30min。

1.2實驗方法

1 2 1培養(yǎng)方法活化培養(yǎng)：將保藏在- 60℃甘油管中的菌種少量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)12h后，將菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30h，挑單菌落進行劃線，繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培養(yǎng)皿培養(yǎng)24h后，置于-4℃冰箱中保藏備用。

1 2 2種子與發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)，裝液量lOOml，挑取培養(yǎng)皿中單菌落無菌接人種子培養(yǎng)基中，于370C恒溫培養(yǎng)12h。以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔2h檢測菌體生長情況，發(fā)酵結(jié)束后。進行計數(shù)培養(yǎng)，之后離心收集發(fā)酵廢液，為下次實驗備用。

7L發(fā)酵罐，裝液量4.8L，將保存在培養(yǎng)皿中的單菌落挑人種子培養(yǎng)基中，370C，50r/min培養(yǎng)12h。將200mL種子液接種到4.8L優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，370C繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵過程中攪拌速度改為lOOr/min以使溶質(zhì)得到充分的混合，用氨水調(diào)控發(fā)酵液的pH值，將其控制在6 5左右。發(fā)酵期間通過補加600g/L高濃度的葡萄糖溶液控制底物濃度，整個發(fā)酵過程定時取樣分析發(fā)酵液的細胞生物量。每次發(fā)酵結(jié)束后，進行計數(shù)培養(yǎng)，之后離心收集發(fā)酵廢液，為下次實驗備用。

1 2 3發(fā)酵液回收利用方法向離心后廢液中補加葡萄糖至20g/L【13】，再向其中補加30g/L的玉米漿，于1210C滅菌30min，以相同接種量及裝液量重新進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后做活菌計數(shù)，并測量發(fā)酵終點乳酸濃度。按上述方法不斷回用發(fā)酵廢液，直至最后批次發(fā)酵無菌體產(chǎn)生，且乳酸濃度不再變化。

1 2 4發(fā)酵參數(shù)測定通過測定發(fā)酵液在600nm處的吸光度來檢測菌體生物量。將待測發(fā)酵液稀釋適當倍數(shù)，使OD600=0.3-0.8，采用UNIC7200分光光度計測定。

乳酸含量測定采用高效液相色譜法（HPLC）。

樣品處理：精密量取發(fā)酵上清液ImL，用超純水定容至5mL，得到乳酸的稀釋待測液。測定時樣品經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾。

色譜條件：色譜條件：流動相為0 005mol/L H2S04，流速0.4mL/min，柱溫550C，進樣量lOuLc141。

2結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵液的多次回用（搖瓶）

采用搖瓶培養(yǎng)新鮮發(fā)酵液，再依次按照1 2 3的方法進行發(fā)酵液的多次回用，當發(fā)酵液重復使用至第六批次時，發(fā)酵終點無菌體產(chǎn)生，且乳酸濃度沒有任何變化，實驗結(jié)果見表1與圖1。

結(jié)果表明：新鮮發(fā)酵液的活菌數(shù)為72 xlOaCFU/ml，乳酸產(chǎn)量為35g/L。伴隨發(fā)酵液回用次數(shù)的增加，菌體生長的延遲期逐漸變長，繼而造成發(fā)酵周期延長。新鮮發(fā)酵液發(fā)酵過程中，OD600的增長值為最大值8，活菌數(shù)最高，乳酸產(chǎn)量相對較高。當發(fā)酵廢液重復使用至第四批次時，發(fā)酵終點OD600增長值維持在5左右，而在發(fā)酵廢液重復使用的過程中，發(fā)酵

圖1發(fā)酵液回用過程中各批次生物量變化液每重復使用一次，發(fā)酵終點的活菌數(shù)依次降低，直至最后批次發(fā)酵過程中沒有任何菌體產(chǎn)生。發(fā)酵廢液重復使用一次時，乳酸產(chǎn)量達到最大，此代謝過程中乳酸產(chǎn)量為43g/L。發(fā)酵廢液重復使用第三次時，菌體乳酸代謝能力依次下降，當?shù)谖迮螌嶒灲Y(jié)束時，廢液中乳酸濃度達到最大值，為148g/L。此時各批次實驗活菌計數(shù)總量為184×108CFU/ml。

2.2發(fā)酵液的多次回用（7L發(fā)酵罐）

表2 2各組回用實驗發(fā)酵終點參數(shù)對比

在上述搖瓶實驗階段中，根據(jù)不同批次廢液生產(chǎn)乳酸及發(fā)酵終點活菌數(shù)的生產(chǎn)情況，現(xiàn)進行7L發(fā)酵罐小試實驗，新鮮發(fā)酵液發(fā)酵結(jié)束后，按照1 2 3中的試驗方法進行發(fā)酵液回用實驗。

7L發(fā)酵罐滅菌過程中會產(chǎn)生多余的蒸餾水，使發(fā)酵液回用時的初始乳酸濃度降低。各批次回用實驗結(jié)果如表2及圖2。

結(jié)果表明，在分批補料發(fā)酵過程中，發(fā)酵液回用后發(fā)酵延遲期增加，導致發(fā)周期變長，新鮮發(fā)酵液O D00的增長值為最大值19，活菌數(shù)最高為123×108CFU/ml，乳酸產(chǎn)量為65g/L。當發(fā)酵廢液重復使用至第三批次時，發(fā)酵終點0 Deoo增長值維持在5左右，而在發(fā)酵廢液重復使用的過程中，發(fā)酵液每重復使用一次，發(fā)酵終點的活菌數(shù)依次降低，直至最后批次發(fā)酵過程中沒有任何菌體產(chǎn)生。發(fā)酵廢液重復使用第二次時，菌體乳酸代謝能力依次下降，直至廢液重復使用至第四批次時，乳酸含量沒有任何變化，此時發(fā)酵終點累積的乳酸濃度為150g/L。發(fā)酵過程中活菌數(shù)的總產(chǎn)量為259×108CFU/ml。

3結(jié)論

搖瓶實驗表明，植物乳桿菌發(fā)酵液多次回用后，乳酸產(chǎn)量最終達到148g/L，乳酸產(chǎn)量較新鮮發(fā)酵液相比增加3 3倍，活菌數(shù)數(shù)累積量與新鮮發(fā)酵液相比增加1 5倍。而在7L罐規(guī)模發(fā)酵下，植物乳桿菌活菌數(shù)累積為259 X108CFU/ml，較新鮮發(fā)酵液相比增加1倍左右，乳酸產(chǎn)量達到150g/L。由此可見，通過對植物乳桿菌發(fā)酵液的回用提高了菌體及乳酸的產(chǎn)量，并減少了發(fā)酵培養(yǎng)基中無機鹽的使用量，同時減少了發(fā)酵廢水的排放。

參考文獻

【1】徐志遠乳桿菌的腸道定殖和菌群調(diào)節(jié)作用研究[D]江蘇：江南大學，2011

【2】曲冬梅，劉小杰植物乳桿菌及其在食品工業(yè)中的應用【J】中國食品添加劑2005，3，219-222

【3】馮麗莉，張棟，荀一萍，薛玉玲，王世杰，朱宏植物乳桿菌的功能性及工業(yè)化應用研究進展【J】中國乳品工業(yè)，2018，36（03）：35-38

【4】SIEZEN R J，van HYLCKAMA VLIEG J E Genomicdiversity and versatility of Lactobacillus plantarum， a naturalmetabolic engineer【J】Microbial Cell Factories， 2011， 10（01）： S3DOI：10 .1186/1475 -2859-10-S1

【5】Kang B Microecology. Dalian： Dalian Press， 1994（康白微生態(tài)學大連：大連出版社，1994）

【6】丁涓，魏敏，張莉玉米漿發(fā)酵生產(chǎn)L一乳酸的工藝優(yōu)化【J】食品科學，2011，32（1）：127 -130

【7】江楊娟，徐麗，陳美思，周小敏，韓翠萍，王松乳酸菌發(fā)酵大豆糖蜜生產(chǎn)乳酸及糖代謝變化【J】食品科學.2018，39（06）：130- 134

【8】周穎，高曉峰，霍貴成發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的研究進展【J】食品工業(yè)，2015，36（ 04）：240 - 246

【9】呂樂，張可毅，趙鵬等乳酸菌USTB-08的高效培養(yǎng)和生產(chǎn)乳酸【J】北京科技大學學報，2012，32（ 05）：603 -609

【10】陳堅，堵國成發(fā)酵工程原理與技術(shù)[M】北京：化學工業(yè)出版社，2012

【11】許宏賢，張曉萍，段鋼益生菌乳酸發(fā)酵提高低聚果糖含量生產(chǎn)的新方法中國釀造.2016（ 06）：143 -145

【12】Corry J E L，Curtis G D W， Baird R M. Handbook ofCulture Media for Food Microbiology （2 ed.）【M】ElsevierScienceLtd.2003

【13】黃皓，胡珊，羅華建等副干酪乳桿菌發(fā)酵廢液的重復利用【J】食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（ 03）：97 -101

【14】陳喚蛟，李小連，李彥良等丙酸高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化【J】過程工程學報.2014，14（ 03）：482- 486