龐昕瑞，曾鴻鵠，2，3，梁延鵬＊，2，3，覃禮堂，2，3，莫凌云，2，3

（1．桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西桂林541004；2．廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；3．巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西桂林541004）

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國(guó)獸藥抗生素的使用量在日益增加［1］。由于磺胺類(lèi)藥物（Sulfanilamide，SAs）是最早人工合成的抗生素之一，其具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于人工養(yǎng)殖和臨床治療，成為使用量最大的抗生素之一［2］。但是，SAs難以被動(dòng)物吸收代謝且遷移性強(qiáng)、難降解［3］，因此約60%～90%的原藥［4］和代謝產(chǎn)物隨糞便和尿液排出動(dòng)物體外后，通過(guò)淋溶、滲透等方式進(jìn)入自然環(huán)境中，對(duì)地表水、土壤和地下水造成污染［5－6］。因此，對(duì)我國(guó)自然環(huán)境中磺胺類(lèi)藥物的污染水平進(jìn)行分析研究是十分必要的。

自然環(huán)境中抗生素的濃度大多處于ng／L～μg／L水平，且環(huán)境基質(zhì)復(fù)雜多樣，因此需要根據(jù)實(shí)際的環(huán)境條件對(duì)前處理和分析方法進(jìn)行優(yōu)化選擇。環(huán)境樣品中SAs抗生素的檢測(cè)通常是先經(jīng)過(guò)固相萃取（SPE）富集凈化，再結(jié)合高效液相色譜－紫外／熒光檢測(cè)器（HPLC－UVD／FLD）［7］、高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC－MS）［8］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC－MS／MS）［9］、超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS／MS）［10］等方法進(jìn)行檢測(cè)。由于超高效液相色譜在靈敏度、分離度、分析效率上較高效液相色譜有很大的提高，可大大縮短分析用時(shí)、降低實(shí)驗(yàn)溶劑用量。因此，本研究采用SPE－UPLC／MS／MS建立了同時(shí)檢測(cè)地表水水樣中10種SAs抗生素殘留的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、實(shí)用性強(qiáng)，可快速地完成對(duì)目標(biāo)物的分析，為水體中SAs藥物的定性定量分析檢測(cè)提供技術(shù)保障，并已成功應(yīng)用于濕地地表水中10種SAs抗生素殘留的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

WatersXevo TQ－S Micro超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)，Waters公司）；AQUA Trace ASPE 799型固相萃取儀（日本，島津公司）；雙頻超聲波清洗器；24位氮吹儀；Vortex Genie 2渦旋振蕩器。

10種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SPY）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、甲氧芐啶（TMP）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺地索辛（SDM）、磺胺喹噁啉（SQ），純度≥97%，均購(gòu)自 Dr．Ehrenstorfer GmbH 公司（德國(guó)）；甲醇（色譜純，＞99．9%，德國(guó) Merck公司）；甲酸（色譜純，≥98．0%，阿拉?。灰宜嵋阴ィㄉV純，＞99．0%，阿拉丁）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，水為Milli－Q型超純水儀（美國(guó)，Millipore公司）制備的超純水。

1．2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液與工作溶液的配制

精確稱(chēng)量各標(biāo)準(zhǔn)品10mg，分別置于100mL棕色容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后定容，配成質(zhì)量濃度為0．1g／L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于－20℃下儲(chǔ)存。取上述儲(chǔ)備溶液用甲醇稀釋為500μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1．3 樣品前處理

1．3．1 水樣采集和預(yù)處理 采集1L桂林會(huì)仙濕地部分地表水水樣于棕色玻璃瓶中，用稀H2SO4先將水樣pH調(diào)至4．0～6．0，于4℃保存。水樣運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即經(jīng)0．45μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾，用稀H2SO4和氨水調(diào)節(jié)水樣pH＝6．0，并在3d內(nèi)完成對(duì)所有水樣的固相萃取。

1．3．2 樣品的固相萃取 依次用5mL的乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5mL 氨水－甲醇（3∶100，V／V）溶液，5mL超純水活化Oasis HLB固相萃取柱（6mL／500mg，美國(guó) Waters公司），取500mL水樣以3mL／min流速過(guò)柱，用6mL超純水淋洗萃取柱，在氮?dú)庀赂稍?0min，再依次用5．5mL乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5．5mL氨水－甲醇（3∶100，V／V）溶液進(jìn)行洗脫，最后將收集的洗脫液在氮?dú)庀戮徛卮抵两桑尤?mL含30%甲醇溶液超聲溶解殘留物，漩渦混合約1min，過(guò)0．22μm濾膜后，置于棕色進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測(cè)定。

1．4 測(cè)定方法

1．4．1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（100×2．1mm，1．7μm）；流動(dòng)相為含0．1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫條件：0～1min，10%～12%B；1～7min，12%～50%B；7～10min，50%～70%B；10～10．1min，70%～10%B；10．1～12min，10%B。柱溫為40℃；進(jìn)樣量為2μL；流速為0．3mL／min。

1．4．2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離（ESI）；正離子掃描（ESI＋）模式；毛細(xì)管電壓：2．94kV；脫溶劑溫度：600℃；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流速：1 000L／h；監(jiān)測(cè)方式為多時(shí)段－多反應(yīng)（MRM）監(jiān)測(cè)。10種目標(biāo)物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)抗生素的MRM MS參數(shù)Table 1 Parameters of MRM MS for target antibiotics

2 結(jié)果與討論

2．1 質(zhì)譜－色譜條件的優(yōu)化

首先對(duì)儀器進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧，參考調(diào)諧文件對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有錐孔氣流速時(shí)，目標(biāo)物的峰形不發(fā)生分叉且響應(yīng)值高。為提高離子掃描時(shí)目標(biāo)物的靈敏度，本研究考察了不同比例甲酸水溶液作流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物靈敏度的影響。結(jié)果表明在含0．1%甲酸水溶液條件下各物質(zhì)的峰形、響應(yīng)值和分離度達(dá)到最佳狀態(tài)。此外，有研究表明，色譜柱的長(zhǎng)短會(huì)影響目標(biāo)物的分離效果和保留時(shí)間［11］。本實(shí)驗(yàn)研究了色譜柱柱長(zhǎng)對(duì)目標(biāo)物的色譜行為的影響，結(jié)果顯示當(dāng)色譜柱柱長(zhǎng)為50mm時(shí)，目標(biāo)物無(wú)法達(dá)到理想的分離效果和出峰情況；當(dāng)色譜柱柱長(zhǎng)為100mm時(shí)，10種目標(biāo)物的峰形無(wú)拖尾：TMP和SM2可完全分離、SMP和SCP質(zhì)譜檢測(cè)可分離、SQ和SDM的峰形更加尖銳且無(wú)分叉，如圖1所示。因此實(shí)驗(yàn)選用柱長(zhǎng)為100mm的色譜柱進(jìn)行色譜分離。

圖1 10種磺胺類(lèi)抗生素的總離子流（TIC）色譜圖（色譜柱長(zhǎng)100mm）Fig．1 TIC chromatogram of 10sulfonamide antibiotics with column length of 100mm1．SD；2．SPY；3．SMR；4．TMP；5．SM2；6．SMP；7．SCP；8．SMZ；9．SDM；10．SQ．

2．2 固相萃取條件的優(yōu)化

2．2．1 洗脫溶劑、洗脫體積、萃取柱的選擇 乙酸乙酯常用做萃取劑、提取劑，且極性小于甲醇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)用甲醇進(jìn)行洗脫回收率低于乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V）。有研究［12］表明，在甲醇中加入氨水可以改變目標(biāo)物在固相萃取柱上的存在形態(tài)，降低固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物的相互作用力，增大回收率，因此本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了萃取體系中氨水比例，發(fā)現(xiàn)在體系中加入3%的氨水更容易將目標(biāo)物洗脫下來(lái)（圖2）。為確保洗脫完全，進(jìn)行兩次洗脫，結(jié)果表明第二次洗脫目標(biāo)物殘留均小于0．05μg／L。最終確定依次用5．5mL乙酸乙酯－甲醇（1∶1，V／V），5．5mL 氨水－甲醇（3∶100，V／V）淋洗固相萃取柱。此外，本研究分別考察了C18固相萃取柱（6mL／500mg，德國(guó)CNW 公司）、Oasis HLB固相萃取柱（6mL／500mg，美國(guó) Waters公司）對(duì)目標(biāo)物的富集效果。結(jié)果顯示，HLB柱的回收率明顯優(yōu)于C18柱。

2．2．2 水樣pH值和水樣上樣流速的選擇 水樣的pH很大程度地影響了目標(biāo)物在水樣中的存在形態(tài)、穩(wěn)定性以及固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物的富集效果，因此用稀H2SO4和氨水將水樣（超純水）pH值分別調(diào)節(jié)為2．0～7．0進(jìn)行回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)。由圖3可知，當(dāng)pH＜6．0時(shí)，SCP、SMZ、SDM和SQ的回收率均未達(dá)到80%；而當(dāng)pH＝6．0時(shí)，各目標(biāo)物的回收率均有明顯提高，上述4種物質(zhì)的回收率提升至85．15%～89．79%；pH＞6．0時(shí)，各目標(biāo)物的回收率較在pH＝6．0的條件下略有下降，因此本研究選擇將水樣調(diào)至pH＝6．0。

圖2 洗脫液中氨水比例對(duì)10種抗生素回收率的影響Fig．2 Effect of ammonia ratio in eluents on recoveries of the ten antibiotics

圖3 水樣pH對(duì)10種抗生素回收率的影響Fig．3 Effect of pH on the recoveries of the ten antibiotics in water samples

考察了不同上樣流速（3、5、10mL／min）對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。研究表明，當(dāng)上樣流速為10mL／min時(shí)，僅TMP的回收率為88%，其他物質(zhì)的回收率為69．8%～75．63%；當(dāng)上樣流速為5mL／min時(shí)，對(duì)SD的富集效果仍不理想，回收率為73．62%；當(dāng)上樣流速為3mL／min時(shí)，除SCP的回收率為74．61%外，其余9種目標(biāo)物的回收率保持在80．85%～89．01%。此外，當(dāng)上樣流速?gòu)?mL／min升至10mL／min時(shí)，對(duì)SD和SPY回收率的損失達(dá)11%。因此最佳上樣流速選為3mL／min。

2．3 基質(zhì)效應(yīng)

用質(zhì)譜定量分析環(huán)境樣品時(shí)，基體效應(yīng)（離子抑制或者離子增強(qiáng)）會(huì)影響目標(biāo)物定量結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)需要考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。按照文獻(xiàn)報(bào)道［13］研究基質(zhì)效應(yīng)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，10種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)在81．17%～103．76%之間。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%范圍內(nèi)，可忽略基質(zhì)效應(yīng)［13］。

2．4 方法的線性范圍及儀器的檢出限和定量限

配制10種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列（1～500μg／L），按上述色譜－質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法和離子比（定量離子／定性離子）定量，結(jié)合目標(biāo)物出峰的保留時(shí)間、母離子和子離子（定性離子和定量離子）進(jìn)行定性。分別用3倍和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的標(biāo)樣濃度來(lái)估算儀器的檢出限、定量限。結(jié)果表明10種目標(biāo)物在1～500μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2＞0．999，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10種抗生素的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 2 Retention time，linear equation，correlation coefficient（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the ten antibiotics

2．5 加標(biāo)回收率及方法檢出限

準(zhǔn)確量取500mL桂林會(huì)仙濕地地表水，分別以低（10ng／L）、中（50ng／L）、高（100ng／L）3個(gè)濃度水平對(duì)水樣進(jìn)行加標(biāo)，做6個(gè)平行樣，同時(shí)作空白對(duì)照。按1．3及1．4節(jié)所述方法對(duì)水樣進(jìn)行處理和分析。由表3可知，10種目標(biāo)物的低、中、高濃度加標(biāo)回收率分別為81．90%～93．69%、77．94%～96．83%、84．14%～104．98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜8．1%，方法檢出限在0．12～0．84ng／L范圍內(nèi)，且水樣進(jìn)行低濃度加標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)各物質(zhì)的峰形尖銳完整，基線平穩(wěn)（圖4）。說(shuō)明該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢出限低、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 10種抗生素的水樣加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法檢出限（LODs）（n＝6）Table 3 Spiked recoveries，relative standard deviations（RSDs），and limits of detection（LODs）for ten antibiotics in water samples（n＝6）

圖4 水樣加標(biāo)質(zhì)量濃度為10ng／L時(shí)目標(biāo)物的MRM色譜圖Fig．4 MRM chromatograms of the target analytes in water samples spiked at 10ng／L

2．6 實(shí)際樣品測(cè)定

按照本文所建立的方法對(duì)4個(gè)桂林會(huì)仙濕地地表水水樣（S1、S2、S3、S4）進(jìn)行處理和分析。其中SMR、SM2、SMP、SCP在4個(gè)采樣點(diǎn)的檢出率為100%，含量為0．14～1．71ng／L，TMP僅在S4處檢測(cè)出，含量為1．44ng／L。由于采樣點(diǎn)S1、S2靠近村莊，SMZ為人體抗菌常用藥，所以含量偏高，分別為8．84ng／L、25．80ng／L。

3 結(jié)論

通過(guò)SPE－UPLC－MS／MS法分別對(duì)環(huán)境水體中10種磺胺類(lèi)抗生素進(jìn)行凈化富集和分析檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，10種目標(biāo)物在1～500μg／L范圍具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2在0．9995～0．9999范圍內(nèi)，儀器檢出限和定量限范圍分別為0．01～0．05μg／L和0．05～0．17μg／L，平均水樣加標(biāo)回收率為77．94%～104．98%，RSD為2．18%～8．09%，方法檢出限＜0．84ng／L。該方法回收率較高、精密度高、重現(xiàn)性好、基質(zhì)干擾低、操作簡(jiǎn)單、使用試劑環(huán)境友好，適用于實(shí)際環(huán)境地表水中磺胺類(lèi)抗生素檢測(cè)。