王 波，趙 霞，謝愷舟＊，王雅娟，郭亞文，卜曉娜，劉楚君，張跟喜，張 濤，劉學(xué)忠

（1．揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2．教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；3．揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）、氟苯尼考（FF）同屬于氯霉素類藥物（CAPs），他們的抗菌機(jī)理相似，對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有作用，但對陰性菌的作用強(qiáng)于陽性菌，并廣泛用于畜禽生產(chǎn)中。由于CAPs在動(dòng)物源性食品中殘留會(huì)造成人的再生障礙性貧血，因此我國、歐盟和美國等多個(gè)國家將其列為禁用藥物［1－3］。同時(shí)規(guī)定了TAP、FF及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺（FFA）在動(dòng)物源性食品中最大殘留量（MRL），TAP的MRL為50μg／kg，F(xiàn)F和FFA在家禽肌肉中的MRL為100μg／kg，而家禽產(chǎn)蛋期間禁止使用這些藥物。由于家禽生產(chǎn)發(fā)展的需要，使用抗生素可以減少家禽疾病和死亡，但動(dòng)物源性食品中抗生素殘留成為人們必須關(guān)注的問題。

近年來，常有報(bào)道禽蛋中過度使用FF和FFA，導(dǎo)致FF和FFA殘留在禽蛋中，影響人類健康。目前，CAPs藥物的檢測方 法主要包括：液相色譜法［4－7］、氣相 色 譜 法［8－10］、液－質(zhì) 聯(lián) 用 法［11－15］和 氣－質(zhì) 聯(lián) 用法［16－17］。相比現(xiàn)在報(bào)道的方法，本研究采用了加速溶劑萃?。ˋSE）對樣品進(jìn)行了前處理，以甲醇∶氨水∶水溶液（97∶2∶1，V／V）為萃取劑，正己烷去脂，通過液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測鵪鶉蛋和鴿蛋中CAP、TAP、FF和FFA多藥物殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Waters Alliance e2695高效液相色譜儀（美國，Waters公司）；AB SCIEX Triple QuadTM5500四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國，AB SCIEX公司）；ScanSpeedVac40離心濃縮儀（丹麥，Telstar公司）；ASE35加速溶劑萃取儀（美國，Thermofisher公司）。

CAP（純度99．3%）、TAP（純度99．0%）、FF（純度99．0%）和內(nèi)標(biāo)CAP－D5（純度99．0%）（德國Labor Dr．Ehrenstorfer Gmbh有限公司）；氟苯尼考胺（FFA）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99．3%，德國 WITEGA Laboratorien Berlin－Adlershof Gmbh有限公司）。FFA先用1mL超純水溶解，其它藥物標(biāo)準(zhǔn)品直接用乙腈溶解，再用乙腈定容至10mL，充分搖勻，分別配制成200．00mg／L標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分裝，密封后，置于－70℃超低溫冰箱中保存。取25μL同位素內(nèi)標(biāo)貯備液（100．0mg／L），用乙腈溶解并定容至10mL，充分搖勻，配制成250μg／L的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，密封后，置于4℃冰箱中避光保存。每天用儲(chǔ)備液制備不同濃度的工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。乙腈、甲醇（色譜純，美國Tedia有限公司）；其他試劑均購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1．2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5．0g勻漿后的樣品放于研缽中，并加入4．0g硅藻土研磨，為了達(dá)到最佳的萃取效率，盡可能將樣品研磨成小顆粒后，裝入22mL的萃取池中，設(shè)置參數(shù)：溫度為80℃，壓力為1．034×104kPa，靜態(tài)萃取時(shí)間5min，沖洗溶劑（甲醇∶氨水∶水溶液（97∶2∶1，V／V／V））的總量為40%（占萃取池體積的40%），每個(gè)樣品之間自動(dòng)沖洗1次，氮?dú)獯祾?0s，靜態(tài)萃取1次，萃取液收集于60mL收集瓶中。收集的萃取液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，置于50℃離心濃縮儀（2 000×g）上吹至1～2mL后，加入1mL乙腈，漩渦振蕩混勻1min，加入10mL正己烷（用乙腈飽和）漩渦混勻，去脂，靜置5min，棄去上層正己烷，下層提取液重復(fù)提取一次，然后置于50℃離心濃縮儀（2 000×g）上吹干，冷凍保存。上機(jī)前用5mL 40%乙腈分兩次漩渦振蕩溶解，12 100×g離心15min，過0．22μm有機(jī)相針式濾器，濾液待上機(jī)分析檢測。

1．3 LC－MS／MS分析條件

色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（250×4．6mm，5μm），流動(dòng)相：A相為2mmol／L NH4Ac溶液，B相為2mmol／L NH4Ac－乙腈溶液；0～3min，60%～10%A；3～8min，10%A；8～10min，10%～60%A。流速：0．8mL／min；柱溫25℃；進(jìn)樣體積：10μL。梯度洗脫程序：質(zhì)譜采用電噴霧電離，正、負(fù)離子掃描（ESI＋／ESI－）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測；電噴霧離子化電壓（IS）：5 500V（ESI＋）、4 500V（ESI－）；離子源溫度：500℃；離子源噴霧氣（Gas1）：3．103×105Pa（ESI＋）、3．447×105Pa（ESI－）；輔助加熱氣（Gas2）：3．447×105Pa（ESI＋）、2．413×105Pa（ESI－）；氣簾氣（CUR）：1．034×105Pa（ESI＋）、1．379×105Pa（ESI－）。CAP、TAP、FF、FFA和CAP－D5的保留時(shí)間和其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 CAP、TAP、FF和FFA的MS／MS條件和保留時(shí)間Table 1 MS／MS conditions and retention time of CAP，TAP，F(xiàn)F，F(xiàn)FA and CAP－D5

2 結(jié)果與討論

2．1 萃取條件的優(yōu)化

2．1．1 萃取壓力和溫度 ASE使用的壓力遠(yuǎn)高于將溶劑保持在其液態(tài)所需的閾值，改變壓力對分析物回收率的影響很小，因此不需要進(jìn)行壓力調(diào)節(jié)，壓力一般在1．034×104kPa左右［18］。本實(shí)驗(yàn)在1．034×104kPa下，考察了不同萃取溫度（40、60、80、100、120℃）對萃取效率的影響。當(dāng)萃取溫度為80℃時(shí)，樣品的萃取回收率最高。因此選擇80℃為最佳萃取溫度。

2．1．2 萃取劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)在1．034×104kPa和80℃下，比較了不同的萃取劑乙酸乙酯∶乙腈∶氨水（49∶49∶2，V／V／V）［4，14］、甲醇∶水（97∶3，V／V）和甲醇∶氨水∶超純水（97∶2∶1，V／V）對樣品回收率的影響。結(jié)果表明，甲醇∶氨水∶超純水（97∶2∶1，V／V／V）作為萃取劑時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率最高。因此，選擇甲醇∶氨水∶超純水（97∶2∶1，V／V／V）作為萃取劑。

2．2 LC－MS／MS條件的選擇

2．2．1 LC條件優(yōu)化 液相色譜檢測動(dòng)物源性食品中 CAPs藥物殘留多采用 C18柱［4，6，11－15］，因此本實(shí)驗(yàn)采用Waters XBridgeTMC18柱（250×4．6mm，5μm）?？紤]到FFA是弱堿性的藥物，酸性流動(dòng)相可以促進(jìn)其電離，同時(shí)又能提高分析的靈敏度，因此以乙腈－0．1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行LC－MS／MS測定。結(jié)果表明甲酸的使用改善了FFA的響應(yīng)和峰形，但是在負(fù)模式下監(jiān)測的CAP、TAP和FF的離子產(chǎn)生了抑制。Barreto等報(bào)道的方法［12］，在ESI－下，CAP、TAP、FF獲得令人滿意的保留時(shí)間，但FFA在C18柱上保留較差。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)FFA在C18柱上保留較差，解決這一問題的方法是通過在兩種流動(dòng)相組分中分別添加2mmol／L NH4Ac來實(shí)現(xiàn)的，改善FFA保留并減少由基質(zhì)組分引起的干擾。

2．2．2 MS／MS條件優(yōu)化 50ng／mL的CAP、TAP、FF及CAP－D5采用ESI－模式和50ng／mL的FFA采用ESI＋模式對目標(biāo)分析物進(jìn)行全掃描（Q1Scan），確定其各自的母離子［M－H］－和［M＋H］＋，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12－14］。然后進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，每種組分分別選取豐度最高且互不干擾的兩個(gè)作為子離子，并將基峰作定量離子。優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2．2．3 色譜分離 在優(yōu)化的LC－MS／MS條件下，測得鵪鶉蛋中CAP、TAP、FF、FFA的保留時(shí)間分別為4．92、3．93、4．93和3．49min；鴿蛋中的保留時(shí)間分別為4．94、3．93、4．94和3．48min。所得色譜峰峰形好。以鵪鶉蛋色譜圖為例，圖1為空白樣品色譜圖，圖2為加標(biāo)樣品色譜圖。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（CAP：0．1、0．5、1．0、5．0、10．0、15．0、20．0、25．0μg／kg；TAP：1．0、5．0、10．0、25．0、50．0、75．0、100．0、150．0μg／kg；FF：0．3、1．0、10．0、50．0、100．0、150．0、200．0、250．0μg／kg；FFA：1．5、5．0、10．0、50．0、100．0、150．0、200．0、250．0μg／kg；CAP－D5：5．0μg／kg），將每個(gè)混合濃度點(diǎn)依次由低濃度到高濃度進(jìn)行LC－MS／MS檢測。以空白基質(zhì)樣品中的分析物濃度為橫坐標(biāo)（x），定量離子與同位素內(nèi)標(biāo)離子的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。以空白基質(zhì)溶液逐級稀釋每個(gè)藥物的濃度，進(jìn)行LC－MS／MS檢測，以信噪比（S／N）為3和10時(shí)所對應(yīng)的濃度分別作為藥物的檢測限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

表2 鵪鶉蛋和鴿蛋中CAP、TAP、FF、FFA回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限Table 2 The regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of CAP，TAP，F(xiàn)F and FFA in quail eggs and pigeon eggs

圖1 空白鵪鶉蛋樣品的總離子流（TIC）和提取離子（EIC）色譜圖Fig．1 TIC and EIC chromatograms of CAP，TAP，F(xiàn)F，F(xiàn)FA and CAP－D5in a blank quail egg sample

圖2 空白鵪鶉蛋樣品中添加CAP、TAP、FF、FFA和CAP－D5 的總離子流（TIC）和提取離子（EIC）色譜圖Fig．2 TIC and EIC chromatograms of spiked 0．3μg／kg for CAP，5．0μg／kg for TAP，10．0μg／kg for FF and FFA，and 5．0μg／kg for CAP－D5in a blank quail egg sample

2．4 添加回收率和精密度

測定每個(gè)藥物的LOQ、0．5倍MRL、1倍MRL和2倍MRL濃度下的回收率，測定6次并求其平均值。將回收率檢測剩余的樣品混合成4個(gè)濃度點(diǎn)在1d內(nèi)不同時(shí)間6次重復(fù)測定，求平均值，計(jì)算日內(nèi)精密度。在一周內(nèi)6次重復(fù)測定，求平均值，計(jì)算日間精密度。測定鵪鶉蛋和鴿蛋中氯霉素類藥物添加回收率及精密度，結(jié)果見表3和表4。

表3 鵪鶉蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precision for CAP，TAP，F(xiàn)F and FFA analysis in to quail egg（n＝6）

（續(xù)表3）

表4 鴿蛋中CAP、TAP、FF和FFA的添加回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and precision for CAP，TAP，F(xiàn)F and FFA analysis in pigeon egg（n＝6）

將所建立的方法與相關(guān)文獻(xiàn)方法［4，9，13－14］進(jìn)行比較，本文建立的 ASE／LC－MS／MS法能節(jié)省前處理時(shí)間、靈敏度高、回收率高，具有簡便、高效、快速等優(yōu)勢，因此可作為檢測鵪鶉蛋和鴿蛋中氯霉素類藥物殘留的有效方法。

3 結(jié)論

建立了ASE／LC－MS／MS方法檢測鵪鶉蛋和鴿蛋中CAP、TAP、FF和FFA多藥物殘留，為動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物多殘留檢測提供了新的技術(shù)手段。該方法靈敏、快速，滿足歐盟、美國和我國農(nóng)業(yè)部對氯霉素類藥物多殘留檢測的要求。