梁先玉，李 斌，萬益群＊，2

（1．南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌330031；2．南昌大學(xué)分析測(cè)試中心，江西南昌330047）

酪氨酸為芳香族氨基酸，它是構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一［1－2］，在生物體內(nèi)會(huì)代謝出多種物質(zhì)［3－4］，其代謝通路如圖1所示［5］。研究表明，多種疾病的發(fā)生與酪氨酸代謝發(fā)生紊亂有一定的相關(guān)性［6－13］。因此，研究并構(gòu)建生物體液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的分析新技術(shù)，探討酪氨酸及其代謝產(chǎn)物與癌癥，特別是早期癌癥的關(guān)聯(lián)性具有重要意義。目前，酪氨酸及其多種代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有光譜法［14－15］、離子交換色譜法［16－17］、高效液相色譜法［18－21］、毛細(xì)管電泳法［22－23］和氣相色 譜－質(zhì) 譜法［24－25］等。這些方法各有其特點(diǎn)，如光譜法設(shè)備廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單但選擇性差，靈敏度也相對(duì)較低。生物體液基質(zhì)較為復(fù)雜，因此，要實(shí)現(xiàn)低含量目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量，必須選擇性能更好的分離分析技術(shù)。超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS）選擇性好、靈敏度高，在復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析測(cè)定方面已得到廣泛應(yīng)用。

為了系統(tǒng)地探討乳腺癌在發(fā)生發(fā)展過程中生物體液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物水平變化規(guī)律，本文應(yīng)用UPLC－MS／MS聯(lián)用技術(shù)，研究了酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、對(duì) 羥苯基乙 酸（4－Hydroxyphenylacetic Acid，PHPAA）、對(duì)羥苯基丙酸（3，4－Hydroxyphenylpropionic Acid，PHPA）、對(duì)羥苯基乳酸（4－Hydroxyphenyllactic Acid，PHPLA）、酪胺（4－Hydroxyphenylamine，HA）和多巴（3，4－Dihydroxyphenylalanine，DOPA）的色譜分離及質(zhì)譜檢測(cè)條件，構(gòu)建了這些化合物同時(shí)分離分析新技術(shù)，并用于大鼠尿液分析，為后續(xù)研究酪氨酸及其代謝產(chǎn)物與乳腺癌的關(guān)聯(lián)性奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

圖1 酪氨酸及其代謝產(chǎn)物代謝通路Fig．1 Metabolic pathway of tyrosine and its metabolites①Tyrosine decarboxylase（EC：4．1．1．25）；②Tyrosinase（EC：1．14．18．1）；③Tyrosine hydroxylase（EC：1．14．162）；④Tyrosine transaminase（EC：2．6．1．5）；⑤Hydroxyphenylpyruvate reductase（EC：1．1．1．237）；⑥4－Hydroxyphenyllactate dehydrogenase（EC：1．1．1．222）；⑦4－Hydroxyphenylpyruvate decarboxylase（EC：4．1．1．80）；⑧Aryl－aldehyde dehydrogenase（EC：1．2．1．29）．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 主要儀器與試劑

S30液相色譜儀（日本，島津公司）；5600＋質(zhì)譜儀（美國(guó)，AB公司），配有電噴霧（ESI）離子源；pHS－3C酸度計(jì)（上海雷磁儀表廠）。

標(biāo)準(zhǔn)品：酪氨酸（Tyr）（＞99%）、酪胺（HA）（＞97%）和對(duì)羥苯基丙酸（PHPA）（＞98%）購(gòu)于美國(guó) Acros Organics公司；對(duì)羥苯基乙酸（PHPAA）（＞98%）和多巴（DOPA）（＞97%）購(gòu)于東京Chemical Industry公司；對(duì)羥苯基乳酸（PHPLA）（＞98%）購(gòu)于美國(guó)Sigma－Aldrich公司。乙腈和甲醇（色譜純）購(gòu)于美國(guó)LiChrosolv公司；乙酸（色譜純）購(gòu)于TEDIA公司；乙酸銨（色譜純）購(gòu)于美國(guó)Anaqua Chemicals公司。實(shí)驗(yàn)用水（18．2MΩ·cm）取自于英國(guó)ELGA LabWater公司的PURELAB Option－Q純水／超純水系統(tǒng)。

1．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取5．0mg的酪氨酸及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL容量瓶中，用1%的甲酸溶解并定容，搖勻，配制成500mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于冰箱內(nèi)4℃保存。使用時(shí)用pH＝5．7的HAc－NH4Ac緩沖溶液稀釋至所需濃度。

1．3 色譜分析條件

色譜柱：Shim－pack GIST C18快速分離柱（75×2．1mm，2μm；SHIMADZU）；流動(dòng)相：20mmol／L HAc－NH4Ac緩沖溶液（pH＝5．7）∶乙腈＝95∶5（V／V）；流速：0．2mL／min；自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤控溫：4℃；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：5μL；采樣時(shí)間：正離子模式5min，負(fù)離子模式10min。

1．4 質(zhì)譜條件

Eksigent 415（425）－Triple TOF 5600＋系統(tǒng)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式中既可以正離子（＋）進(jìn)行操作，也可以負(fù)離子（－）進(jìn)行操作。各化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 Tyr、DOPA、PHPLA、PHPA、PHPAA和HA的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoring parameters for determination of Tyr，DOPA，PHPLA，PHPA，PHPAA and HA

1．5 樣品采集及前處理

取5周齡SD級(jí)別的雌性大鼠（購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），常規(guī)飼養(yǎng)，每周采集大鼠尿樣。取一定量的尿樣加入等體積超純水，振蕩搖勻，以12 000r／min離心10min。取上清液，過0．22μm水系濾膜后，進(jìn)樣分析測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件優(yōu)化

本文主要探討了以乙腈和HAc－NH4Ac緩沖溶液作為流動(dòng)相，考察在不同濃度的緩沖溶液、不同pH值和不同有機(jī)相比例條件下，酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的色譜分離情況。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈與20mmol／L HAc－NH4Ac緩沖溶液（pH＝5．7）體積比為5∶95時(shí)，酪氨酸及其代謝產(chǎn)物色譜峰的拖尾現(xiàn)象減少，峰形改善，分離效果最好，結(jié)果如圖2所示。

2．2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在正、負(fù)離子兩種模式下，分別對(duì)酪氨酸及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，掃描范圍為m／z60～1 000，得到每種物質(zhì)的分子離子峰。以該分子離子峰為母離子，在10～80V范圍內(nèi)，分別對(duì)其裂解電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到每個(gè)物質(zhì)最佳母離子信號(hào)。然后，分別對(duì)每個(gè)物質(zhì)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化其碰撞能。優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件見表1。

2．3 樣品前處理方法優(yōu)化

大鼠尿液基質(zhì)復(fù)雜，可能對(duì)待測(cè)物的分析造成較大干擾。為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行測(cè)定之前，需要對(duì)大鼠尿液進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)取1mL尿液，分別加入3mL、2mL和1mL超純水，以12 000r／min離心10min，取上清液過0．22μm水系濾膜后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，加入3mL和2mL超純水，尿液中含量較低的酪氨酸代謝產(chǎn)物不易檢出。因此，實(shí)驗(yàn)選擇在尿液中加入1mL超純水進(jìn)行處理并檢測(cè)。

圖2 酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的總離子流（TIC）色譜圖Fig．2 TIC chromatograms of standard mixture solution of tyrosine and its metabolites（1）4－h(huán)ydroxyphenethylamine；（2）tyrosine；（3）3，4－h(huán)ydroxyphenylpropionic acid；（4）3，4－dihydroxyphenylalanine；（5）4－h(huán)ydroxyphenyllactic acid；（6）4－h(huán)ydroxyphenylacetic acid．

2．4 樣品盤溫度的優(yōu)化

大鼠尿液基質(zhì)復(fù)雜，樣品盤溫度對(duì)目標(biāo)物的分析可能會(huì)有一定影響。實(shí)驗(yàn)對(duì)自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤溫度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)尿液中酪氨酸及其5種代謝產(chǎn)物在不同樣品盤溫度下的響應(yīng)信號(hào)變化情況不同。其中，酪氨酸、對(duì)羥苯基乳酸、對(duì)羥苯基乙酸、對(duì)羥苯基丙酸和酪胺隨溫度的變化其響應(yīng)信號(hào)基本不變，而多巴則會(huì)發(fā)生變化。圖3是樣品盤溫度對(duì)尿液中多巴含量測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)樣品盤溫度大于4℃時(shí)，尿液中多巴的響應(yīng)信號(hào)會(huì)發(fā)生較大改變。有研究表明，溫度對(duì)尿液pH 值［26］、黏度［27］、肌酸含量［28］和尿蛋白與肌酐比［29］等都有一定影響。實(shí)驗(yàn)采用全掃模式對(duì)多巴標(biāo)準(zhǔn)品在不同樣品盤測(cè)定溫度條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，多巴標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積隨溫度的變化不大，且未發(fā)現(xiàn)有新的物質(zhì)生成，表明多巴標(biāo)準(zhǔn)品在不同溫度下的穩(wěn)定性較好。然而，對(duì)于尿液，當(dāng)樣品盤溫度大于4℃時(shí)，由于其基質(zhì)復(fù)雜，溫度變化可能對(duì)尿液的性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響，進(jìn)而可能對(duì)大鼠尿液中多巴的響應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生了抑制作用，從而導(dǎo)致多巴檢測(cè)信號(hào)不穩(wěn)定。當(dāng)樣品盤溫度為4℃時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生上述現(xiàn)象。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇樣品盤溫度為4℃。

圖3 大鼠尿液中多巴在不同樣品盤溫度條件下的變化情況Fig．3 Changes of 3，4－dihydroxyphenylalanine in rat urine at different temperature of automatic samplera：4℃；b：6℃；c：15℃．

2．5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差［30－31］。本文用空白樣品基質(zhì)溶液配制成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），制作基質(zhì)匹配加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)＝基質(zhì)匹配加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率／溶劑加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，斜率比越接近于1，基質(zhì)效應(yīng)越?。?2－33］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表2），基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較大。因此，實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)大鼠尿液進(jìn)行分析。

2．6 線性方程和檢出限

用大鼠尿液將酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成一系列不同濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行分析檢測(cè)。采集各化合物色譜數(shù)據(jù)中的峰面積（A）與待測(cè)物的濃度（c）的數(shù)據(jù)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的線性關(guān)系良好，檢出限在0．0003～0．0041mg／L之間，線性范圍和線性回歸方程如表3所示。

表2 純?nèi)軇┘訕?biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的對(duì)比Table 2 The comparison between the standard curve of the analytes prepared in the pure solvent and in the matrix

表3 酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的線性方程及檢出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients（R2），limits of detection（LODs）and limits of quntification（LOQs）for tyrosine and its metabolites

2．7 回收率與精密度

分別添加不同濃度水平的目標(biāo)物至大鼠尿液中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在已優(yōu)化的分離分析條件下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的回收率在82．0%～113．0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4．4%。以上結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于大鼠尿液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的分析檢測(cè)。

表4 大鼠尿液中目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收結(jié)果（n＝6）Table 4 Recovery of analytes in rat urine（n＝6）

2．8 樣品分析

采用所建立的分析方法對(duì)大鼠尿液進(jìn)行分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，大鼠尿液中共檢測(cè)到酪氨酸、對(duì)羥苯基乳酸、對(duì)羥苯基乙酸和酪胺4種化合物，RSD小于3．9%，未檢測(cè)到多巴和對(duì)羥苯基丙酸。這可能與多巴和對(duì)羥苯基丙酸在大鼠尿液中的含量較低有關(guān)。

表5 大鼠尿液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的分析結(jié)果（n＝4）Table 5 Analytical results of tyrosine and its metabolites in rat urine（n＝4）

3 結(jié)論

本文研究構(gòu)建了大鼠尿液中酪氨酸及其多種代謝產(chǎn)物同時(shí)分析測(cè)定的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜新方法。結(jié)果表明，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)限在0．0003～0．0041mg／L之間，靈敏度較高；三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率在82．0%～113．0%之間，驗(yàn)證了所建立的方法的可行性。該方法可用于實(shí)際尿液分析，為進(jìn)一步探討酪氨酸及其代謝產(chǎn)物與某些疾病相關(guān)性提供了方法學(xué)參考。