陳紅玲,高貴珍,王 晴,段 紅,龍 濤,杜菲凡

宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州，234000

機體的衰老是個變化而復雜的過程，氧自由基導致的氧化損傷所引起的機體細胞的功能紊亂在其中起著很大作用，而腦組織耗氧量較大，又由于其含有單胺氧化酶等特性，導致氧自由基所引起的氧化損傷在腦組織更為明顯[1-2]。

白藜蘆醇是植物中的天然抗氧化劑，有較強的抗自由基、抗氧化作用[3-6]。2006年,Valenzano等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以增加脊椎動物的壽命[7]。王長本等人使用避暗試驗觀察白藜蘆醇對小鼠記憶學習能力的影響，該試驗在常壓耐缺氧和亞硝酸鈉中毒等造成的缺氧情況下觀察白藜蘆醇對小鼠缺氧的耐力影響。試驗表明,白藜蘆醇能顯著增強小鼠的記憶能力和改善記憶障礙。通過耐力試驗還表明,白藜蘆醇可顯著延長小鼠缺氧時間、提高鼠耐力和抗疲勞能力，以證明白藜蘆醇具有良好的抗衰老的作用[8]。胥德政的研究結(jié)果顯示,白藜蘆醇能夠較有效地清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化效應(yīng)，其生理活性明顯強于自由基清除劑維生素E和維生素C的生理活性[9]。目前試驗研究表明,白藜蘆醇主要通過清除或抑制自由基的生成、抑制脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)抗氧化相關(guān)酶活性等機制來發(fā)揮抗氧化作用，延緩機體的組織氧化損傷過程，進而起到延緩和抗衰老作用。

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁上的特有結(jié)構(gòu)，脂多糖本身并沒有毒性作用，但能夠刺激體內(nèi)各種細胞合成并釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子，導致大量的一氧化氮(NO)和炎性細胞因子的釋放，而產(chǎn)生的NO及其衍生物可以引起宿主組織的氧化損傷和毒性作用。另外，NO是在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產(chǎn)生的。NOS的作用是促進腦皮層和海馬在LPS刺激下產(chǎn)生大量的NO，過量的NO與過氧化物一起導致過氧化,從而引起組織的氧化損傷[ 10]。當組織缺氧缺血時,在輔酶II氧化酶作用下還原型輔酶II(NADPH) →NADP+(氧化型輔II),而則接受一個電子成為超氧陰離子自由基。超氧化物歧化酶(SOD)是自由基的消除劑。丙二醛(MDA)是自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種產(chǎn)物,其水平可反映體內(nèi)自由基含量。

本試驗采用的是LPS誘導氧化損傷模型，研究白藜蘆醇對脂多糖(LPS)誘導的ICR小鼠腦皮層和海馬中NOS活性的影響和白藜蘆醇的抗氧化損傷保護機制(SOD酶活性和MDA含量)，旨在為白藜蘆醇在抗機體氧化損傷的研究和臨床應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

1.1.1 試驗材料

ICR品系小鼠(雄性，6～8周齡，購于徐州醫(yī)學院動物部)、LPS(脂多糖，sigma公司)、白藜蘆醇(天津一方生物制劑公司)、生理鹽水(安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司)、NOS試劑盒(南京建成生物工程公司)、小鼠的飼料、考馬斯亮藍G250 、蒸餾水 、乙醚等購于國藥集團，分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

酶標儀(Multiskan G0 美國Thermo公司)、臺式冷凍離心機(力康發(fā)展有限公司 型號Neofuge 23R)、組織勻漿器(cryomill，Retsch GmbH)、雪花制冰機 、電子天平(FA2004N型)、-80 ℃的冰箱、eppendorf管、96孔板 、各種移液槍及槍頭、純水儀 、離心管、滅菌鍋、一次性無菌注射器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物

ICR小鼠，雄性，體重30～40 g,于室內(nèi)分籠喂養(yǎng)，自由進食進水，待小鼠適應(yīng)后進行試驗。將小鼠隨機分成三組，即：對照組(生理鹽水，n= 6)、模型組(LPS，n= 6)、預防組(Res+LPS，n=6)。模型組前10天采用腹腔注射的方式注射生理鹽水，然后注射LPS 5 mg/kg，連續(xù)2天。對照組注射等量的對照液(生理鹽水)。預防組前10天按每天10 mg/kg體重腹腔注射白藜蘆醇，在之后2天中預防組給藥后采用腹腔注射LPS 5 mg/kg，對照組注射等量的生理鹽水。

1.2.2 組織勻漿

處死：在最后一次給藥48 h后，應(yīng)用乙醚將動物深度麻醉，然后放置在冰浴中斷頸處死。用乙醇消毒后的手術(shù)器材引頸剪開皮膚，取出完整的腦，并將腦皮層和海馬分開稱重。取出后立刻將這些組織放入eppendorf管中，保存在液氮中。待所有的小鼠腦皮層和海馬組織都取完后，放入-80 ℃冰箱中保存。

組織勻漿：取出凍存的腦皮層和海馬組織0.1 g放入1 mL的生理鹽水中,制備10%的組織勻漿。

1.2.3 組織蛋白質(zhì)含量測定

取10%組織勻漿液于適宜的考馬斯亮藍中，混勻。放置兩分鐘，然后取200 μL于96孔板中，用酶標儀測出各個待測樣的吸光度值，保證所得到的吸光度值在標準曲線中良好的線性范圍之內(nèi)。

1.2.4 NOS活力

NOS的測定原理是：NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO,NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長下測定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計算出NOS活力。當被測樣品中含有NOS時，產(chǎn)生NO與過氧化物一起導致過氧化，引起組織損傷，比色時測定管的吸光度值高于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的NOS活力。

計算公式：

具體的操作步驟：混勻，530 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

1.2.5 制作標準蛋白曲線

采用考馬斯亮藍法[12-14]。

1.2.6 SOD酶活性的測定

按SOD活力的測定試劑盒操作，每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。

1）管線高度集中。地下綜合管廊是在城市道路下面建造一個市政共同通道，將電力、燃氣、通信、供水等多種市政管線集中在一起，排列緊湊，拓撲關(guān)系復雜，可實現(xiàn)地下空間的綜合利用。

計算公式為：

1.2.7 MDA含量的測定

采用TBA法，酶標儀在532 nm處可以測定出樣品的吸光光度值，通過公式即可求算出被測樣品中MDA的含量。

計算公式為：

組織中MDA含量計算公式：

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)表示為均值 ± 標準差(Mean ± S.D.)。數(shù)據(jù)采用Student’s-t檢驗進行組間比較，p小于0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 試驗結(jié)果

2.1 NOS活性

NOS是NO合成過程中起關(guān)鍵作用的酶，NOS在靜息狀態(tài)的細胞內(nèi)是不表達的，但當細胞受到細胞因子和免疫微生物等刺激時，如脂多糖(LPS)的強烈誘導，NOS催化合成非生理濃度的大量NO，產(chǎn)生一系列的病理作用。本試驗中,小鼠腦皮層和海馬組織中NOS的活性如圖1所示。

圖1 白藜蘆醇預防后檢測小鼠腦皮層內(nèi)NOS活性 *LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)#Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.05)

2.1.1 白藜蘆醇預防后對小鼠腦皮層中NOS活性的影響

從圖1可知，LPS處理后小鼠腦皮層中的NOS活性顯著提高，表明氧化損傷誘導模型建立成功；用白藜蘆醇預防10天后腦海馬中NOS活力水平較模型組有所降低，表明白藜蘆醇可清除小鼠腦皮層中的自由基，對NOS表達及NO合成過程有抑制作用，且有顯著性差異。

2.1.2 白藜蘆醇預防后小鼠腦海馬中NOS活性的影響

從圖2中可以看出，用LPS處理后小鼠腦海馬中的NOS活性顯著提高，表明氧化損傷誘導模型建立成功；用白藜蘆醇預防10天后腦海馬中NOS活力水平較模型組有所降低，表明白藜蘆醇可清除小鼠海馬中的自由基，對NOS表達及NO合成過程有抑制作用，且有顯著性差異。

圖2 白藜蘆醇預防后檢測小鼠海馬內(nèi)NOS活性*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)#Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.05)

2.2 SOD酶活性

圖3 白藜蘆醇預防后檢測小鼠腦皮層內(nèi)SOD活性*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)

SOD是線粒體內(nèi)含量較為豐富的一種抗氧化物酶。它可以清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。小鼠腦皮層、海馬組織中SOD的活力如圖3和圖4所示。模型組小鼠與對照組相比腦皮層中的SOD活力明顯降低。海馬內(nèi)預防組與模型組相比能顯著升高SOD活性(p< 0.05)，由此說明白藜蘆醇預防后可顯著提高預防組小鼠腦海馬中的SOD活力。

圖4 白藜蘆醇預防后檢測小鼠海馬內(nèi)SOD活性#Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.05)

2.3 MDA含量

MDA是多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物。脂質(zhì)過氧化物是由氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的，小鼠腦皮層和海馬中MDA含量如圖5和圖6所示。預防組小鼠和模型組小鼠相比，腦皮層和海馬中MDA的含量明顯降低，由此說明，應(yīng)用白藜蘆醇預防后可顯著降低預防組小鼠腦皮層和海馬中MDA的含量，具有統(tǒng)計學意義。

圖5 白藜蘆醇預防后檢測小鼠腦皮層內(nèi)MDA含量*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)##Res+LPS組與LPS組相比有顯著性差異(p<0.01)

圖6 白藜蘆醇預防后檢測小鼠海馬內(nèi)MDA含量*LPS組與CON組相比有顯著性差異(p<0.05)

3 結(jié) 語

相關(guān)文獻表明，白藜蘆醇是源自天然植物中的脂溶性抗毒素，屬于多酚類化合物，主要存在于虎杖、葡萄和花生等自然植物中。其在人體內(nèi)的重要作用有抗氧化、抗炎和抗衰老等作用[6]。

本文試驗結(jié)果顯示，模型組小鼠腦皮層和海馬中內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性下降，說明腦皮層和海馬遭受氧化損傷，白藜蘆醇可提高SOD活性，減輕了LPS介導的腦皮層和海馬的氧化損傷。

本試驗中，模型組注射10天LPS后，腦皮層和海馬中MDA含量明顯上升，與模型組相比，預防組小鼠腦皮層和海馬中MDA的含量明顯降低。試驗結(jié)果說明小鼠腦皮層、海馬氧化損傷得到控制，白藜蘆醇使自由基的生成受到抑制，減輕了LPS誘導的腦皮層、海馬的氧化損傷。筆者認為，藜蘆醇能夠預防LPS引起的腦皮層和海馬組織的氧化損傷，這可能是由于白藜蘆醇可以減少或抑制氧自由基的生成，從而降低過氧化對機體造成的損傷。

本次試驗結(jié)果表明：模型組LPS處理過的小鼠腦皮層和海馬組織中的NOS活性顯著提高，用白藜蘆醇預防10天后腦海馬中NOS活力水平較模型組有所降低，但與空白對照組相比未見明顯差異。這表明白藜蘆醇可清除小鼠腦皮層和海馬中的自由基，對NOS表達及NO合成過程有抑制作用，但無顯著性差異。