張明飛，于卓，于肖夏，李景偉，馬艷紅，吳國(guó)芳，王穎

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)為菜、糧、飼兼用的四大重要作物之一，其塊莖富含淀粉、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、抗氧化酚類物質(zhì)及花青素等成分[1]。在我國(guó)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的驅(qū)動(dòng)下，目前市場(chǎng)上對(duì)不同用途馬鈴薯品種的需求量呈增加趨勢(shì)，因此選育淀粉、全粉、薯?xiàng)l、薯片及富含花青素等加工專用型馬鈴薯新品種倍受重視[2-3]。構(gòu)建植物遺傳連鎖圖譜是從正向遺傳學(xué)角度進(jìn)行重要數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，QTL)精細(xì)定位、功能基因克隆分析及分子標(biāo)記輔助育種研究的基礎(chǔ)。

以往遺傳作圖多用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)這兩種分子標(biāo)記，不足點(diǎn)是AFLP操作技術(shù)復(fù)雜、SSR技術(shù)多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量有限。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)是一種較新的二代分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是根據(jù)基因中啟動(dòng)子和內(nèi)含子的堿基AT含量豐富，外顯子中堿基GC含量豐富的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因不同個(gè)體中的啟動(dòng)子、內(nèi)含子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[4]。SRAP標(biāo)記具有通用性廣、共顯性高、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、易測(cè)序及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，已被應(yīng)用于玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、棉花(Gossypiumspp.)及冰草(Agropyron)等植物的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究中[7-10]。

目前已有一些關(guān)于馬鈴薯遺傳作圖的研究報(bào)道，如荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的Hans等[11]利用AFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了第一張二倍體馬鈴薯的超密度遺傳連鎖圖譜，Bradshaw等[12]采用AFLP和SSR兩種標(biāo)記構(gòu)建了同源四倍體馬鈴薯的遺傳圖譜，金黎平等[13]用AFLP標(biāo)記建立了我國(guó)第一張二倍體馬鈴薯遺傳圖譜，崔闊澍[14]利用AFLP和SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了四倍體彩色馬鈴薯的高密度遺傳圖譜。迄今在國(guó)內(nèi)外還未見用SRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建馬鈴薯遺傳連鎖圖譜的研究報(bào)道。

植物分子遺傳連鎖圖譜是進(jìn)行其品質(zhì)和產(chǎn)量等重要QTL定位的基礎(chǔ)，通常遺傳作圖要求親本間的遺傳差異大、雜交后代作圖群體目標(biāo)性狀分離明顯。本試驗(yàn)以四倍體馬鈴薯YSP-4×MIN-021雜種F1代182個(gè)分離單株為作圖群體，用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)和Join Map 4.0軟件構(gòu)建馬鈴薯的SRAP分子遺傳連鎖圖譜，以期為馬鈴薯高淀粉、高干物質(zhì)及產(chǎn)量等重要QTL定位、分子標(biāo)記輔助育種及功能基因圖位克隆等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與種植方式

材料為適應(yīng)性很強(qiáng)的四倍體馬鈴薯YSP-4與干物質(zhì)和淀粉含量高的四倍體馬鈴薯MIN-021雜交產(chǎn)生的F1代182個(gè)分離單株及其親本，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯遺傳育種研究中心保存并提供。2018年5月種植在呼和浩特市托克托縣馬鈴薯育種基地的網(wǎng)棚中，株距為30 cm，行距為90 cm。土壤為沙質(zhì)土，生長(zhǎng)期間適時(shí)適量灌水施肥，以保證馬鈴薯正常生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)水和養(yǎng)分的需求。

1.2 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

在現(xiàn)蕾期，取182個(gè)馬鈴薯雜種F1代單株及其親本的幼嫩葉片用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，稱取1.5 g葉片，根據(jù)天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組試劑盒說明提取各材料的基因組DNA。1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度后，用日本島津產(chǎn)UV2401紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，稀釋至約50 ng·μL-1，置-20 ℃冰箱中備用。

1.3 引物來源

從Li等[4]、Pezzotti等[15]和Lin等[16]報(bào)道的SRAP引物中，隨機(jī)選取正向引物17條、反向引物21條，自由組合成357對(duì)引物，送至上海生物工程有限公司合成。

1.4 SRAP-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

反應(yīng)體系體積為20 μL，包括10×PCR Buffer(Mg2+)2.5 μL、2.5 mmol·L-1的dNTPs 1.6 μL、5 U·μL-1的Taq酶0.2 μL、10 mmol·L-1的正反向引物各1.2 μL、50 ng·μL-1的模板DNA 1 μL、ddH2O 12.3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃下延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃下延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃下延伸10 min后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)[17]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.5.1多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì) 電泳膠板上，有條帶位點(diǎn)的記錄為“1”，無條帶位點(diǎn)的記錄為“0”，條帶位點(diǎn)不清晰或缺失的記錄為“-”，生成“0”和“1”組成的數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)算多態(tài)性條帶位點(diǎn)百分率：

P=(K/N)×100%

式中:K表示多態(tài)性條帶位點(diǎn)數(shù)目；N表示檢測(cè)到條帶位點(diǎn)總數(shù)[18]。

1.5.2偏分離統(tǒng)計(jì) 根據(jù)孟德爾分離規(guī)律，四倍體馬鈴薯雜種F1代群體的SRAP標(biāo)記多態(tài)性位點(diǎn)理論上應(yīng)符合1∶1或3∶1的分離比，在P<0.01和P<0.05的水平上，對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，判斷其是否發(fā)生偏分離并統(tǒng)計(jì)其偏分離標(biāo)記數(shù)目。

1.5.3遺傳連鎖圖譜構(gòu)建 采用Join Map 4.0軟件的“CP”作圖模型，用擴(kuò)增得到的馬鈴薯分離類型為lm×ll(母本型1∶1)、np×nn(父本型1∶1)和hk×hk(雙親共有型3∶1)的SRAP標(biāo)記，分別構(gòu)建出馬鈴薯雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜，本試驗(yàn)設(shè)定的連鎖閾值(likelihood of odds, LOD)范圍為3.0～5.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及分子標(biāo)記多態(tài)性分析

隨機(jī)取馬鈴薯YSP-4×MIN-021雜種F1代分離群體中的3個(gè)單株和雙親DNA作模板，進(jìn)行SRAP適宜性引物篩選(圖1)。從357對(duì)引物中篩選出條帶穩(wěn)定清晰、多態(tài)性豐富的引物36對(duì)(表1)，利用這些引物對(duì)182個(gè)雜種F1分離單株的基因組DNA擴(kuò)增得到742個(gè)條帶位點(diǎn)，多態(tài)性條帶位點(diǎn)為598個(gè)，多態(tài)性比率為80.59%，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)16.61個(gè)，表明F1分離群體的多態(tài)性較豐富，遺傳差異較大(圖2)。

圖1 供試材料部分SARP適宜引物的篩選Fig.1 Screening of partial suitable SRAP primers in test materials P1: 母本 YSP-4 Female YSP-4; P2: 父本 MIN-021 Male MIN-021; 1～3: F1 分離單株F1 segregation plants.

2.2 SRAP標(biāo)記位點(diǎn)的偏分離分析

對(duì)PCR擴(kuò)增得到的598個(gè)SRAP多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，在P<0.05水平時(shí)，卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不符合孟德爾分離規(guī)律的偏分離標(biāo)記位點(diǎn)共有127個(gè)，其中母本連鎖群偏分離標(biāo)記59個(gè)，偏分離標(biāo)記比率為21.53%；父本連鎖群偏分離標(biāo)記68個(gè)，偏分離標(biāo)記比率為20.99%(表2)。這符合植物遺傳作圖偏分離標(biāo)記比率小于30%的要求[19]，可用于構(gòu)建四倍體雜交馬鈴薯遺傳連鎖圖譜。

2.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用Join Map 4.0作圖軟件，在選定LOD值為3.0～5.0條件下，構(gòu)建出2張四倍體雜交馬鈴薯雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜(圖3，圖4和表3)。母本圖譜覆蓋基因組總長(zhǎng)度為1572.2 cM，含274個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，標(biāo)記間的平均距離為5.74 cM，12個(gè)連鎖群的長(zhǎng)度范圍為14.03～214.44 cM，母本連鎖群1標(biāo)記數(shù)目最多(62個(gè))，母本連鎖群11標(biāo)記數(shù)目最少(2個(gè))；父本圖譜覆蓋基因組總長(zhǎng)度為1932.23 cM，含324個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，標(biāo)記間的平均距離為5.96 cM，12個(gè)連鎖群長(zhǎng)度范圍為93.65～242.06 cM，父本連鎖群5標(biāo)記數(shù)目最多(55個(gè))，父本連鎖群8標(biāo)記數(shù)目最少(9個(gè))。

表1 SRAP適宜引物及對(duì)供試材料多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 1 The sequences and the results of polymorphism amplification of SRAP primers

圖2 SRAP引物對(duì)部分供試材料的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification result of partial test materials by SRAP primers M: 100 bp Marker; 1～53: F1代部分單株P(guān)artial F1 individuals; A: 引物Bm8Coe7 SRAP primer Bm8Coe7; B: 引物Bm9Be9 SRAP primer Bm9Be9.

連鎖群Linkage group(LG)母本連鎖群 Maternal linkage group偏分離標(biāo)記數(shù)Number of biased markers多態(tài)性標(biāo)記數(shù)Number of polymorphic makers偏分離比率Ratio of distorted (%)父本連鎖群 Paternal linkage group偏分離標(biāo)記數(shù)Number of biased markers多態(tài)性標(biāo)記數(shù)Number of polymorphic makers偏分離比率Ratio of distorted (%)LG1136220.97124427.27LG293823.68145425.93LG311010.0033010.00LG4103627.782267.69LG562227.27165529.09LG621020.0031323.08LG71166.2552520.00LG8144729.792922.22LG92219.5241723.53LG1006021513.33LG1102011010.00LG121425.0042615.38合計(jì)Total5927421.536832420.99

圖3 四倍體雜交馬鈴薯母本(YSP-4)SRAP分子遺傳連鎖圖譜Fig.3 The female (YSP-4) molecular genetic linkage maps of tetraploid hybrid potato

3 討論

偏分離是生物進(jìn)化的重要?jiǎng)恿χ籟20]。研究表明造成偏分離現(xiàn)象的因素較多，如基因組結(jié)構(gòu)上發(fā)生突變、插入、缺失或重排[21]，非同源重組、基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座因子[22]，細(xì)胞質(zhì)DNA的母性遺傳[23]，標(biāo)記類型和群體類型[24]等。在植物遺傳作圖時(shí)標(biāo)記偏分離現(xiàn)象普遍存在[25-26]，偏分離標(biāo)記比率通常為6.8%～31.8%[27]。Bradshaw等[28]通過實(shí)驗(yàn)證明，在遺傳作圖中偏分離標(biāo)記與符合孟德爾分離規(guī)律的標(biāo)記具有同等效果，若去除偏分離標(biāo)記可能導(dǎo)致某些連鎖群上的標(biāo)記失去連鎖關(guān)系。一般認(rèn)為偏分離比率<30%的標(biāo)記用于遺傳作圖不會(huì)影響圖譜的準(zhǔn)確性[19]。本試驗(yàn)得到的598個(gè)SRAP標(biāo)記中有127個(gè)標(biāo)記發(fā)生偏分離現(xiàn)象，在母本YSP-4和父本MIN-021各自的遺傳連鎖圖譜中，偏分離標(biāo)記比率分別為21.53%和20.99%，均明顯低于30%，說明本試驗(yàn)所建立的2張四倍體雜交馬鈴薯雙親的遺傳圖譜是準(zhǔn)確的。

表3 四倍體雜交馬鈴薯雙親連鎖群的基本特征Table 3 The basic characteristics of parental linkage groups in tetraploid hybrid potato

對(duì)植物遺傳圖譜標(biāo)記間平均距離的要求因研究用途不同而異。一般認(rèn)為，用于基因定位的圖譜要求標(biāo)記間平均距離為10～20 cM，用于QTL定位要求標(biāo)記間平均距離<10 cM，用于基因圖位克隆要求標(biāo)記間平均距離<1 cM[29-30]。本試驗(yàn)構(gòu)建的2張馬鈴薯親本圖譜中，母本YSP-4圖譜的標(biāo)記間平均距離為5.74 cM，父本MIN-021圖譜的標(biāo)記間平均距離為5.96 cM，均明顯小于10 cM。表明雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜可用于馬鈴薯塊莖淀粉、干物質(zhì)及產(chǎn)量等重要QTL和其相關(guān)基因的定位研究。另外，在雙親圖譜的12個(gè)不同連鎖群上，SRAP標(biāo)記分布還不夠均勻且有較大空隙，這可能與試驗(yàn)獲得的標(biāo)記數(shù)目仍然偏少有關(guān)，需進(jìn)一步篩選SRAP適宜引物，擴(kuò)大作圖標(biāo)記數(shù)目，進(jìn)行雙親遺傳圖譜的加密研究。

4 結(jié)論

1)試驗(yàn)篩選出36對(duì)SRAP適宜引物，對(duì)四倍體馬鈴薯“YSP-4×MIN-021”的雜種F1代182個(gè)分離單株及其雙親的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了598個(gè)SRAP分子標(biāo)記。

2)構(gòu)建了2張四倍體雜交馬鈴薯雙親的SRAP分子遺傳連鎖圖譜。母本YSP-4圖譜含274個(gè)SRAP分子標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為5.74 cM，12個(gè)連鎖群總長(zhǎng)度為1572.2 cM；父本MIN-021圖譜含324個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為5.96 cM，12個(gè)連鎖群總長(zhǎng)度為1932.23 cM。