夏曾潤(rùn)，王文穎，劉亞琪，王鎖民*

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，富硒食品開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

K+是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)含量最豐富的無(wú)機(jī)單價(jià)陽(yáng)離子和60多種酶的活化劑，參與離子穩(wěn)態(tài)、氣孔運(yùn)動(dòng)、膜電位調(diào)節(jié)等諸多關(guān)鍵性生理生化代謝過(guò)程。研究表明，植物可通過(guò)維持體內(nèi)高的K+/Na+并發(fā)揮K+高效的滲透調(diào)節(jié)作用來(lái)抵御鹽和干旱等非生物脅迫[1]?？梢?jiàn)，有效吸收K+并維持體內(nèi)K+濃度相對(duì)穩(wěn)定對(duì)植物適應(yīng)逆境至關(guān)重要。

植物主要通過(guò)K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[2]和K+通道[3]兩大系統(tǒng)從外界環(huán)境中吸收K+。普遍認(rèn)為，Shaker家族的K+通道是介導(dǎo)植物K+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞內(nèi)K+平衡的主要通道。1992年Sentenac等[4]首次從擬南芥(Arabidopsisthaliana) cNDA文庫(kù)中篩選到Shaker家族內(nèi)整流K+通道基因AKT1(ArabidopsisK+transporter 1)，隨后相繼從水稻(Oryzasativa)、大麥(Hordeumvulgare)、番茄(Lycopersiconesculentum)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)等多種植物中克隆得到[5-8]。Shaker家族K+通道多肽包含1個(gè)較短的N末端結(jié)構(gòu)域、6個(gè)跨膜片段結(jié)構(gòu)(S1～S6)組成的核心功能區(qū)域和1個(gè)較長(zhǎng)的C末端區(qū)域。其中，在S5與S6之間有一個(gè)高度保守的膜孔道區(qū)域-P結(jié)構(gòu)域(pore loop)，其TXXTXGYGD序列是判斷K+通道結(jié)構(gòu)的標(biāo)志；S4區(qū)域含有帶正電的Arg/Lys殘基，是K+通道的電壓感應(yīng)器，通過(guò)應(yīng)答膜電位的變化改變通道構(gòu)象，從而控制通道孔的開(kāi)閉；C末端結(jié)構(gòu)域位于胞質(zhì)內(nèi)，含有一個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(cyclic nucleotide-binding domain，cNBD)，并且在最靠C末端形成富含疏水酸性殘基區(qū)(a domain rich in hydrophobic and acidic residues, KHA)，是調(diào)節(jié)離子通道活性的重要部位[9-12]。此外，AKT1類K+通道在cNBD下游有錨蛋白域(ankyrin-related domain，ANKY)，此結(jié)構(gòu)有助于通道與細(xì)胞骨架的結(jié)合，可促進(jìn)蛋白之間的相互作用[13-14]。

擬南芥Shaker家族K+通道是目前研究最為透徹的植物K+吸收通道，已有9個(gè)家族成員被分離鑒定。內(nèi)整流K+通道AKT1的組織特異性較強(qiáng)，主要在成熟根表皮、皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞等部位表達(dá)，具有雙親和性，主要負(fù)責(zé)根系從土壤中吸收K+，并在調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)發(fā)育中也起著重要作用[2,15-16]。akt1突變體的K+吸收能力明顯下降，其根細(xì)胞原生質(zhì)體內(nèi)向電流消失，在低鉀環(huán)境下表現(xiàn)出明顯的敏感表型[17-18]。此外，Shaker家族成員AtKC1能與AKT1形成異源復(fù)合K+通道，調(diào)控AKT1通道的活性，進(jìn)而影響低鉀環(huán)境中擬南芥根部的K+吸收和積累過(guò)程[19-20]。Pilot等[21]發(fā)現(xiàn)，擬南芥內(nèi)整流K+通道KAT1和KAT2主要在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)介導(dǎo)保衛(wèi)細(xì)胞K+的跨膜流動(dòng)來(lái)調(diào)控細(xì)胞滲透勢(shì)和氣孔運(yùn)動(dòng)。也有研究顯示，K+通道在鹽脅迫下可介導(dǎo)低親和性Na+的吸收[22]。然而，Qi等[23]的研究表明，擬南芥中細(xì)胞質(zhì)Na+濃度的提高抑制了AKT1對(duì)K+的吸收；在中度鹽脅迫(50 mmol·L-1NaCl)下，擬南芥atakt1-2突變體與野生型植株相比，其Na+濃度及凈吸收速率均沒(méi)有顯著差異[24]。AKT1的突變使植物對(duì)水分脅迫的響應(yīng)增強(qiáng)，水培介質(zhì)中添加聚乙二醇(PEG)時(shí)，akt1植株較野生型水分損失少，并表現(xiàn)為蒸騰作用降低，水分消耗減小，在響應(yīng)脫落酸(ABA)時(shí)akt1植株氣孔迅速關(guān)閉[25]。越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)整流K+通道在參與植物對(duì)K+的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

羅布麻(Apocynumvenetum)系夾竹桃科(Apocynaceae)羅布麻屬(Apocynum)多年生宿根草本植物或小灌木，廣泛分布于干旱半干旱及鹽堿地區(qū)，生態(tài)幅度廣，具有很強(qiáng)的抗旱耐鹽性，是我國(guó)西北荒漠地區(qū)一種兼具生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值的新興多用途植物資源，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景和巨大的開(kāi)發(fā)潛力[26]。前期研究發(fā)現(xiàn)，土培條件下，羅布麻體內(nèi)K+的積累量與高富鉀植物空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)、商陸(Phytolaccaacinosa)相當(dāng)[26]；水培條件下，羅布麻在低鉀環(huán)境下能保持與正常供鉀等同的K+吸收和利用效率，在鹽或干旱逆境中其可維持體內(nèi)高且穩(wěn)定的K+含量和K+/Na+[27]，這表明羅布麻體內(nèi)可能存在高活性的K+吸收途徑。鑒于此，本研究從羅布麻中分離到內(nèi)整流K+通道AvAKT1的編碼基因，并分析其在低鉀、鹽及滲透脅迫條件下的表達(dá)豐度，以期為逆境條件下，羅布麻維持K+穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羅布麻種子采自新疆阿勒泰戈寶茶股份有限公司種質(zhì)資源圃。種子經(jīng)0.5%的高錳酸鉀溶液消毒10 min，用蒸餾水沖洗干凈后在常溫黑暗條件下浸泡24 h，將其均勻撒播于盛有蛭石的穴盤(5 cm×5 cm×5 cm)中，培養(yǎng)至3周齡，移入水培盒(19 cm×13.5 cm×7.5 cm)培養(yǎng)1周。期間澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[2 mmol·L-1KNO3, 0.5 mmol·L-1KH2PO4, 0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O, 0.25 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O, 1.25 mmol·L-1CaCl2·2H2O, 0.06 mmol·L-1Fe-citrate, 50 mmol·L-1H3BO3, 10 mmol·L-1MnCl2·4H2O, 1.6 mmol·L-1ZnSO4·7H2O, 0.6 mmol·L-1CuSO4·5H2O, 0.05 mmol·L-1Na2MoO4·2H2O, pH=5.7]，營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換一次。培養(yǎng)室晝/夜溫度為25 ℃/22 ℃，光照時(shí)間為16 h·d-1，光強(qiáng)度約為230 μmol·m-2·s-1，空氣相對(duì)濕度60%～70%。

1.2 材料處理

生長(zhǎng)4周齡的羅布麻幼苗，分別做以下處理：1)對(duì)照：澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液；2)鹽處理：用含有25 mmol·L-1NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理6 h；3)滲透脅迫：用山梨醇調(diào)節(jié)滲透勢(shì)大小為-0.2 MPa的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理6 h；4)鉀處理：先用含有0.01 mmol·L-1K+的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(分別用2 mmol·L-1HNO3和0.5 mmol·L-1H3PO4代替2 mmol·L-1KNO3和0.5 mmol·L-1KH2PO4，補(bǔ)充0.01 mmol·L-1KCl，用Tris溶液調(diào)整pH為5.7)處理3 d，隨后分別用含有0.1和5.0 mmol·L-1K+的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理0、6、48 h。處理液每12 h更換一次。處理結(jié)束后，分別收集根、莖、葉，迅速于液氮中冷凍用于RNA提取。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(生工生物，上海)說(shuō)明書提取總RNA。參照PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。根據(jù)SMARTerTMRACE cDNA Kit試劑盒(Clontech，USA)進(jìn)行RACE反轉(zhuǎn)錄，合成5′-cDNA和3′-cDNA第一鏈。

1.4 AvAKT1基因的克隆

通過(guò)同源多重比對(duì)已分離得到的高等植物AKT1核苷酸序列，確定保守序列，利用DNAMAN 6.0和Primer 5.0設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物P1和P2 (表1)。以鹽處理下羅布麻根系的cDNA為模板，使用PrimeSTAR?高保真DNA聚合酶(TaKaRa，大連)擴(kuò)增AvAKT1核心片段。PCR擴(kuò)增在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s、53 ℃退火15 s、72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。回收純化得到的PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體(TaKaRa，大連)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、鑒定陽(yáng)性克隆后送至生工生物(上海)股份有限公司測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序所得核心片斷序列分別設(shè)計(jì)5′端和3′端外側(cè)特異引物P3、P5和巢式特異引物P4、P6 (表1)分別與試劑盒提供的引物P7、P8配對(duì)，采用Phusion?超保真DNA聚合酶(Thermo，USA)進(jìn)行外側(cè)和巢式PCR擴(kuò)增。外側(cè)PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸55 s(5′-RACE)和75 s (3′-RACE)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。巢式PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s (5′-RACE)和60 s (3′-RACE)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。將測(cè)序得到的核心、5′-RACE和3′-RACE序列進(jìn)行拼接，獲得AvAKT1全長(zhǎng)cDNA序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

將編碼的氨基酸序列在NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)分析，檢索該基因與其他物種的同源性；序列的翻譯、開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)的分析及氨基酸序列的多重比對(duì)通過(guò)生物軟件DNAMAN實(shí)現(xiàn)；該基因編碼蛋白的等電點(diǎn)和分子量通過(guò)在線軟件ProtParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)；利用TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。采用MEGA 6.0軟件中的臨近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1000次。

1.6 AvAKT1基因表達(dá)模式分析

參考SYBR?Premix Ex Taq II試劑盒(TaKaRa，大連)說(shuō)明書，以P9、P10為擴(kuò)增引物，推測(cè)目的片段長(zhǎng)度120 bp，采用ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))檢測(cè)不同處理下羅布麻AvAKT1的表達(dá)量；以羅布麻肌動(dòng)蛋白編碼基因AvACT(未發(fā)表數(shù)據(jù))為內(nèi)參基因，以P11、P12為擴(kuò)增引物，推測(cè)目的片段長(zhǎng)度112 bp。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔct法[28]計(jì)算AvAKT1的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用Excel 2010、DNAMAN 6.0、TMHMM、MEGA 6.0等軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AvAKT1基因的克隆

表1 基因克隆和表達(dá)分析所用引物序列Table 1 Primer sequences used for gene cloning and expression analysis

以羅布麻根系cDNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約749 bp的核心片段(圖1A)；根據(jù)得到的核心片段設(shè)計(jì)引物，以RACE產(chǎn)物為模板，進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度約為1875 bp (圖1B)和939 bp (圖1C)的片段。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，3個(gè)cDNA片段均與其他高等植物的AKT1有較高同源性，確定為羅布麻AKT1的編碼基因片段。

圖1 羅布麻AvAKT1基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of AvAKT1 from A. venetum A: 核心片段擴(kuò)增The RT-PCR product of the partial fragment; B: 3′-RACE; C: 5′-RACE; M: DL 2000 DNA marker.

2.2 AvAKT1基因序列及結(jié)構(gòu)分析

用BioEdit軟件拼接5′端、核心片段和3′端的核苷酸序列，得到一條全長(zhǎng)為2906 bp的cDNA序列，該基因命名為AvAKT1。分析表明，AvAKT1的cDNA序列包括2700 bp的開(kāi)放閱讀框、55 bp的5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′UTR)以及151 bp含有poly-A尾巴的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′UTR)，推測(cè)其編碼一個(gè)由899個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽(圖2)。在線軟件ProtParam分析得出AvAKT1編碼蛋白的理論等電點(diǎn)為7.05，蛋白質(zhì)分子量為101.4 kDa。

圖2 羅布麻AvAKT1的cDNA與預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and its predicted amino acid residues of AvAKT1 from A. venetum 方框處為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)。The initiation codon (ATG) and termination codon (TGA) were framed with lines.

對(duì)AvAKT1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和保守域預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其包含6個(gè)高度保守的跨膜區(qū)(TM 1～TM 6)，在TM 5和TM 6之間有一個(gè)高度保守的膜孔道區(qū)域(pore loop)，C端包含一個(gè)推測(cè)的環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)(cNBD)和錨蛋白重復(fù)域(ANKY)，且富含疏水性、酸性殘基的KHA結(jié)構(gòu)域(圖3)，符合典型的Shaker-like內(nèi)整流K+通道結(jié)構(gòu)特征。

2.3 同源序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他高等植物的AKT1氨基酸序列的同源性在60%以上。其中，與煙草(Nicotianatabacum)NtAKT1的同源性最高，達(dá)76%；與大豆(Glycinemax)GmAKT1、擬南芥AtAKT1和小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)PutAKT1的同源性分別為70%、64%和62% (圖3)。

利用MEGA 6.0對(duì)AvAKT1與其他植物Shaker K+通道家族構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，Shaker K+通道家族分為5個(gè)亞族，AvAKT1隸屬于第Ⅰ亞族(AKT1亞族)，與煙草NtAKT1屬同一進(jìn)化分枝，與雙子葉植物擬南芥AtAKT1、大豆GmAKT1親緣關(guān)系較近(圖4)。

2.4 AvAKT1的表達(dá)模式分析

正常條件下羅布麻AvAKT1主要在根中表達(dá)，在植株地上部的表達(dá)量極少，尤其在葉中幾乎不表達(dá)(圖5)。采用qRT-PCR檢測(cè)不同濃度K+、鹽和滲透脅迫處理下羅布麻根中AvAKT1表達(dá)水平的變化，結(jié)果表明，K+饑餓后添加5.0 mmol·L-1K+顯著誘導(dǎo)了AvAKT1的表達(dá)(圖6A)；25 mmol·L-1NaCl和-0.2 MPa滲透脅迫處理時(shí)，AvAKT1的表達(dá)量在6 h受到顯著誘導(dǎo)(圖6B)。

圖3 羅布麻AvAKT1與其他植物AKT1氨基酸序列多重對(duì)比Fig.3 Multiple sequence alignment of AvAKT1 with its homologs in other higher plants At: 擬南芥; Gm: 大豆; Nt: 煙草; Put: 小花堿茅。各基因編碼氨基酸的GenBank登錄號(hào)如下: AtAKT1(NM_128222), GmAKT1(XP_003549784), NtAKT1(XP_009619489), PutAKT1(GU327382)。TM 1～TM 6為6個(gè)跨膜域。At: A. thaliana; Gm: Glycine max; Nt: Nicotiana tabacum; Put: Puccinellia tenuiflora. Sources of Shaker-like K+ channel family and their GenBank accession numbers are as follows: AtAKT1(NM_128222), GmAKT1(XP_003549784), NtAKT1(XP_009619489), PutAKT1(GU327382). TM 1-TM 6 indicates the structures of the predicted trans-membrane segments of AvAKT1.

圖4 AvAKT1與其他植物Shaker K+通道家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AvAKT1 (marked in red) with related Shaker-like K+ channel family Ap: 空心蓮子草A. philoxeroides; At: 擬南芥A. thaliana; Gm: 大豆G. max; Nt: 煙草N. tabacum; Put: 小花堿茅P. tenuiflora; Rc: 蓖麻Ricinus communis; Ta: 小麥Triticum aestivum; Tc: 可可Theobroma cacao; Vv: 葡萄Vitis vinifera; Zm: 玉米Zea mays. 各基因編碼氨基酸的GenBank登錄號(hào)如下Sources of Shaker-like K+ channel family and their GenBank accession numbers are as follows: AtAKT1 (NM_128222), GmAKT1 (XP_003549784), NtAKT1 (XP_009619489), PutAKT1 (GU327382), TaAKT1 (AF207745), ZMK1 (CAA68912), VvK1.2 (FR669116), AtAKT5 (NP_194976), AtKAT1 (At5g46240), AtKAT2 (At4g18290), RcKAT2 (XP_002519693), GmKAT1 (XP_003541662), GmKAT2 (XP_003547208), AtAKT2 (At4g22200), VvAKT2 (XP_002268924), RcAKT2 (XP_002529533), AtKAT3 (At4g32650), TcKAT2 (EOY29638), AtSKOR (At3g02850), AtGORK (At5g37500), ApSKOR (AFO70199). 左下角標(biāo)尺0.2表示系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上進(jìn)化枝的長(zhǎng)短The scale bar 0.2 corresponds to the distance of clade on the evolutionary tree.

3 討論

圖5 羅布麻AvAKT1基因在根、莖和葉中的組織特異性Fig.5 The tissue expression characteristics of AvAKT1 in root, stem and leaf不同字母代表在P<0.05水平上差異顯著(Duncan檢驗(yàn))。Columns with different letters indicant significant differences at P<0.05 (Duncan’s test).

植物通過(guò)根質(zhì)膜上的K+通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從環(huán)境中吸收K+。K+通道介導(dǎo)低親和性K+的吸收，是特異性選擇K+通過(guò)質(zhì)膜的跨膜蛋白，也是離子通道中最龐大的家族，可分為Shaker、TPK與Kir-like三大家族[9,29-30]。研究顯示，Shaker家族的成員在植物K+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)植物適應(yīng)逆境至關(guān)重要[3,31]。

本研究從羅布麻根系中克隆并獲得Shaker家族K+通道蛋白基因AvAKT1，其氨基酸序列的C末端包含Shaker家族K+通道的cNBD和KHA特征結(jié)構(gòu)域，在cNBD下游還存在AKT1類K+通道區(qū)別于KAT1類的ANKY結(jié)構(gòu)域，并在第5和第6跨膜區(qū)間具有Shaker家族K+通道高度保守和特異性序列TXXTXGYGD及P環(huán)孔道區(qū)域(圖3)，這些特征序列是鑒別Shaker家族K+通道蛋白的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，也是K+通道蛋白功能的重要序列單元[12,14,32]。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，AvAKT1為第Ⅰ亞族(AKT1亞類)內(nèi)整流K+通道蛋白，與煙草的同源性最高(圖3，圖4)。

圖6 不同處理下羅布麻根中AvAKT1相對(duì)表達(dá)量分析Fig.6 The expression level of AvAKT1 in root from A. venetum under different conditions

本研究結(jié)果顯示，AvAKT1主要在羅布麻根中高豐度表達(dá)(圖5)；K+饑餓后，5.0 mmol·L-1K+顯著誘導(dǎo)了羅布麻AvAKT1在根中的表達(dá)，0.1 mmol·L-1K+對(duì)其表達(dá)量幾乎沒(méi)有影響(圖6A)，表明AvAKT1主要在羅布麻根部發(fā)揮作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道[33-34]， AKT1在維持植物離子穩(wěn)態(tài)平衡及增強(qiáng)植物逆境脅迫耐受性等方面起著重要作用。在水稻中超表達(dá)OsAKT1后，轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下生長(zhǎng)良好，且根中積累較多的K+；相反，osakt1突變體植株表現(xiàn)為生長(zhǎng)不良，且根中K+含量明顯減少[35]。Golldack等[6]研究表明，鹽處理下水稻根吸收Na+與OsAKT1的表達(dá)水平有直接關(guān)系。在水稻中超表達(dá)小花堿茅K+通道蛋白PutAKT1顯著提高了水稻的耐鹽性[36]。Duan等[37]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下鹽地堿蓬(Suaedasalsa)SsAKT1的高豐度表達(dá)與植株體內(nèi)K+的積累密切相關(guān)。最新研究結(jié)果表明[38]，ZxAKT1對(duì)維持荒漠旱生植物霸王(Zygophyllumxanthoxylum)的K+吸收、K+/Na+穩(wěn)態(tài)平衡至關(guān)重要。本試驗(yàn)中，25 mmol·L-1NaCl和-0.2 MPa滲透脅迫處理6 h時(shí)，AvAKT1的表達(dá)豐度顯著上調(diào)(圖6B)，并且發(fā)現(xiàn)-0.2 MPa滲透脅迫下羅布麻葉中K+濃度顯著上升、地上部K+/Na+顯著提高，添加25 mmol·L-1NaCl后Na+對(duì)滲透勢(shì)的貢獻(xiàn)大幅增加，滲透脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的危害得到緩解[27]，據(jù)此推測(cè)AvAKT1可能在調(diào)控羅布麻體內(nèi)K+和Na+選擇性吸收、維持K+濃度穩(wěn)定，進(jìn)而增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)RT-RCR和RACE技術(shù)從羅布麻根中分離得到內(nèi)整流K+通道AvAKT1編碼基因，并采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析了其在低鉀、鹽及滲透脅迫條件下的表達(dá)豐度變化特征。結(jié)果表明，AvAKT1基因編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)符合典型的Shaker-like內(nèi)整流K+通道結(jié)構(gòu)特征，與其他高等植物AKT1類K+通道蛋白的同源性在60%以上；羅布麻AvAKT1主要在根中表達(dá)，受到5.0 mmol·L-1K+、25 mmol·L-1NaCl及-0.2 MPa滲透脅迫的顯著誘導(dǎo)。這可為研究逆境條件下，羅布麻維持K+穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。