李爭(zhēng)艷，徐智明，師尚禮，賀春貴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界廣泛種植的優(yōu)質(zhì)牧草，它具有一種特殊的種內(nèi)化感作用—自毒性[1]，苜蓿生長(zhǎng)多年會(huì)導(dǎo)致土壤自毒物質(zhì)的積累，而且隨著苜蓿生產(chǎn)年限的增加，土壤養(yǎng)分及水分會(huì)顯著下降，導(dǎo)致土壤環(huán)境惡化，使苜蓿產(chǎn)量品質(zhì)下降[2]。隨著我國(guó)奶業(yè)不斷發(fā)展，對(duì)優(yōu)質(zhì)牧草的需求不斷加強(qiáng)，國(guó)內(nèi)苜蓿種植面積增加、范圍擴(kuò)大，逐步形成產(chǎn)業(yè)化及規(guī)模化態(tài)勢(shì)，與此同時(shí)，土傳病害、自毒效應(yīng)及連作問題也日益嚴(yán)重[3]。科學(xué)輪作是解決連作障礙最有效的措施[4]，然而，對(duì)于江淮地區(qū)的苜蓿生產(chǎn)，缺少相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，且高溫高濕的環(huán)境更容易引發(fā)病蟲害及連作障礙，對(duì)該地區(qū)苜蓿生產(chǎn)造成嚴(yán)重的制約和影響。因此，本試驗(yàn)通過研究苜蓿長(zhǎng)期生長(zhǎng)及不同輪作方式下土壤物理化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)，來(lái)研究不同輪茬作物對(duì)土壤質(zhì)量、地力及苜蓿產(chǎn)量的影響，為江淮地區(qū)苜蓿種植方式的建立提供理論依據(jù)。

來(lái)自植物根、土壤微生物、植物和動(dòng)物殘留物的土壤酶是土壤肥力、有機(jī)質(zhì)分解、土壤生物活性和代謝速度的良好指示物[5]，土壤酶活性的降低被認(rèn)為是導(dǎo)致連作障礙的主要因素[6]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到作物連作、輪作[7]、施肥制度[8]、灌溉[9]等農(nóng)業(yè)措施的影響，也是土壤健康的重要決定因素。微生物群落變化可導(dǎo)致土壤代謝能力和土壤質(zhì)量的變化。同時(shí)，土壤微生物多樣性在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中發(fā)揮著重要作用，微生物可以通過影響其他的生化過程諸如植物養(yǎng)分循環(huán)、土壤物理結(jié)構(gòu)維持及化學(xué)降解而促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。連作能夠引起根際土壤中微生物群落的變化[10]，導(dǎo)致微生物種群結(jié)構(gòu)失衡，有害的微生物會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，形成連作障礙[11]。國(guó)內(nèi)外專家已經(jīng)有很多有關(guān)輪作緩解連作障礙的研究，對(duì)黃瓜(Cucumissativus)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、小麥(Triticumaestivum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、高粱(Sorghumbicolor)等作物的研究表明，與單一連作的種植模式相比，在相同管理?xiàng)l件下與不同作物輪作能改變土壤微生物組成，緩解連作障礙，進(jìn)而增加作物產(chǎn)量，提高作物品質(zhì)[6-7,10,12-13]。張立成等[14]研究表明，稻(Oryzasativa)-稻-油菜(Brassicachinensis)輪作增加了細(xì)菌群落的豐度。陳丹梅等[15]研究表明，輪作模式通過影響煙草(Nicotianatabacum)的土壤酶活性及真菌群落，進(jìn)而影響產(chǎn)量。李戌清等[16]研究表明，輪作較連作有利于提高土壤酶活性，增加細(xì)菌多樣性，保持地力。鑒于江淮地區(qū)的牧草種植模式科學(xué)有效辦法的缺乏，研究了苜蓿長(zhǎng)期生長(zhǎng)及輪茬高粱(Sorghumbicolor)和玉米(Zeamays)對(duì)苜蓿產(chǎn)量、土壤養(yǎng)分、土壤容重、酶活性及根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，以期為江淮地區(qū)牧草生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)管理提供技術(shù)支撐，為草地生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料和樣地

試驗(yàn)在安徽省五河縣朱頂鎮(zhèn)(117°26′-118°04′ E, 32°55′-33°20′ N)秋實(shí)草業(yè)公司試驗(yàn)基地進(jìn)行。海拔16 m，年降水量800～1000 mm，年平均氣溫15.1 ℃，無(wú)霜期216 d，土壤類型為典型的黃潮土。設(shè)3個(gè)處理：連續(xù)生長(zhǎng)4年苜蓿滅茬重新種植1年為對(duì)照(CK)，連作3年苜蓿-玉米-苜蓿(T1)，連作3年苜蓿-高粱-苜蓿(T2)，試驗(yàn)小區(qū)13 m×6 m，每個(gè)小區(qū)分為3個(gè)重復(fù)。苜蓿供試品種為Magna601，由克勞沃(北京)生態(tài)科技有限公司提供。苜蓿種植密度為60萬(wàn)株·hm-2，每年刈割5次，留茬高度5 cm。玉米供試品種為先玉047，高粱供試品種為海牛(光敏型，Monster)，由百綠(天津)國(guó)際草業(yè)有限公司提供。玉米行距40 cm，穴播種植，密度9萬(wàn)株·hm-2；高粱行距35 cm，穴播種植，密度12萬(wàn)株·hm-2。2012-2015年連續(xù)4年(CK)苜蓿地施肥水平均為(N, 180 kg·hm-2; P2O5, 260 kg·hm-2; K2O, 320 kg·hm-2)；2015年4月輪茬處理(T1、T2)地塊滅茬后，深耕翻地，玉米與高粱同時(shí)播種，施肥水平均為(N, 200 kg·hm-2; P2O5, 240 kg·hm-2; K2O, 300 kg·hm-2)，苜蓿刈割5次，留茬高度5 cm，高粱刈割2次，分別于2015年7月20日和2015年9月20日刈割，留茬高度10 cm，玉米刈割1次，于2015年9月20日刈割，重復(fù)3次；2016年4月所有處理統(tǒng)一種植苜蓿，種植方案與前4年苜蓿種植方案一致。整個(gè)試驗(yàn)期均不灌溉，苗期人工除草1次，2016年10月采集全部土壤樣品。播種前0～20 cm土層土壤pH值7.49，有機(jī)質(zhì)19.27 g·kg-1，總氮1.53 g·kg-1，有效磷8.37 mg·kg-1，速效鉀167.77 mg·kg-1。

1.2 苜蓿產(chǎn)量測(cè)定

2016年從5月上旬開始到10月上旬，共刈割5次，測(cè)定鮮草產(chǎn)量及其水分，計(jì)算干物質(zhì)產(chǎn)量(采用105 ℃烘干法測(cè)定)。產(chǎn)量為單位面積土地上所收獲地上部分的全部產(chǎn)量，每個(gè)小區(qū)測(cè)產(chǎn)面積5 m2，重復(fù)3次，留茬高度5 cm。

1.3 土壤測(cè)定項(xiàng)目及采樣方法

于2016年10月，用直徑2.5 cm土鉆按S點(diǎn)取樣法在每個(gè)樣地選5個(gè)點(diǎn)土壤樣品，深度為0～20 cm。在清除表面覆蓋物后取樣，將5個(gè)樣品混為1個(gè)土樣，放入無(wú)菌自封袋。每個(gè)樣品分3份，1份保存在-80 ℃進(jìn)行DNA提取，1份風(fēng)干，并過2 mm篩進(jìn)行化學(xué)分析，1份鮮樣送達(dá)試驗(yàn)室立即進(jìn)行酶活性檢測(cè)。另外在距離植株15 cm處挖剖面分層取樣，土層深度分別為0～10 cm，10～20 cm和20～30 cm，同一層不同位置用環(huán)刀取3個(gè)重復(fù)樣本，用鋁盒現(xiàn)場(chǎng)稱濕重并放入自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)土壤容重。

1.4 土壤理化性質(zhì)及土壤酶活性測(cè)定

通過在去離子水與土壤按1.0∶2.5體積比混合的懸浮液中插入玻璃電極計(jì)來(lái)測(cè)量土壤pH值。采用環(huán)刀法測(cè)量土壤容重，采用重鉻酸鉀法對(duì)有機(jī)質(zhì)含量進(jìn)行定量，總氮和有效磷分別用凱氏定氮法和鉬銻抗分光光度法進(jìn)行定量，速效鉀用火焰光度法測(cè)定[17]。采用土壤試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定土壤酶活性。

1.5 DNA提取、16S基因擴(kuò)增及Illumina Miseq測(cè)序

土壤DNA采用土壤DNA試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]從每個(gè)土壤樣品中分離得出，使用分光光度計(jì)(A260/A280)對(duì)DNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行定量，確保所有DNA產(chǎn)量為1.0～2.5 mg。利用細(xì)菌偏向引物338F(5′-ACTCCTACGGAGCAGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V4～V5區(qū)的468 bp片段。用含5×FastPfu緩沖液4 μL、dNTPs(2.5 mmol·L-1)2 μL、正向引物(5 μmol·L-1)0.8 μL、反向引物(5 μmol·L-1)0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、DNA模板10 ng、BSA 0.2 μL加ddH2O至20 μL反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR參數(shù)：95 ℃持續(xù)3 min(變性)；95 ℃持續(xù)30 s(變性)27個(gè)循環(huán)；55 ℃持續(xù)30 s(退火)；72 ℃持續(xù)45 s(延長(zhǎng))；72 ℃持續(xù)10 min和10 ℃直到停止(ABI GeneAmp?9700)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收。PCR產(chǎn)物在上海美吉生物Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序(http://www-MaigrBio.com)。97%的同源性下進(jìn)行操作分類單元(OTU)分析，物種分類信息利用Silva(Release128 http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，數(shù)據(jù)處理圖形生成均在Majorbio I-Sanger云平臺(tái)(www.i-sanger.com)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算；采用SPSS 15統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素方差分析(ANOVA)和Fisher最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪茬作物對(duì)苜蓿產(chǎn)量的影響

前3次刈割，苜蓿產(chǎn)量輪茬玉米(T1)>輪茬高粱(T2)>苜蓿連作(CK)，且差異顯著(P<0.05)；第4次刈割，輪茬玉米(T1)與輪茬高粱(T2)差異不顯著(P>0.05)，連作苜蓿(CK)顯著小于輪茬處理(P<0.05)；第5次刈割，輪茬玉米(T1)產(chǎn)量顯著高于苜蓿連作(CK)及輪茬高粱(T2)(P<0.05)，連作苜蓿(CK)與輪茬高粱(T2)差異顯著(P<0.05)；最終，苜蓿年產(chǎn)量輪茬玉米(T1)>輪茬高粱(T2)>苜蓿連作(CK)，且差異顯著(P<0.05)，輪茬玉米(T1)及輪茬高粱(T2)后苜蓿產(chǎn)量分別是苜蓿連種(CK)的1.27和1.13倍(表1)。

2.2 輪茬作物對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)變化的影響

與苜蓿連作(CK)相比，輪茬高粱(T2)能顯著提高土壤pH及土壤OM(P<0.05)，但輪茬玉米(T1)處理土壤pH及OM并沒有顯著變化(P>0.05)；與連種(CK)相比，輪茬玉米(T1)土壤總氮含量增加到了2.16 g·kg-1，輪茬高粱(T2)有所增加，但并不顯著(P>0.05)；輪茬玉米(T1)土壤中有效磷含量變化不顯著(P>0.05)，輪茬高粱(T2)顯著降低(P<0.05)；輪茬玉米(T1)速效鉀含量從連作苜蓿(CK)的173.60 mg·kg-1提高到489.17 mg·kg-1，差異顯著(P<0.05)，輪茬高粱(T2)提高到322.03 mg·kg-1，差異顯著(P<0.05)(表2)。

表1 輪茬作物對(duì)苜蓿產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成的影響Table 1 Annual yield and cutting yields in each treatment (t·hm-2, dry matter) (mean±SE, n=3)

注：CK,對(duì)照；T1,輪茬玉米；T2,輪茬高粱。同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: CK, Control; T1, Incorporation of maize into the rotation; T2, Incorporation of sorghum into the rotation． Different lowercase letters within the same row indicate significant differences at the 0.05 level.

表2 輪茬作物對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)變化的影響Table 2 Chemical characteristics of soil in each treatment in 2015 (mean±SE, n=3)

注： CK,對(duì)照；T1,輪茬玉米；T2,輪茬高粱。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: CK, Control; T1, Incorporation of maize into the rotation; T2, Incorporation of sorghum into the rotation．Different lowercase letters within the same column indicate significant differences at the 0.05 level, the same below.

2.3 輪茬作物對(duì)土壤容重變化的影響

與苜蓿連種(CK)相比，輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)均在一定程度上降低了土壤容重，使得土壤更為疏松，在0～10 cm土層，輪茬高粱(T2)根部土壤容重顯著小于苜蓿連種(CK)及輪茬玉米(T1)土壤，苜蓿連種(CK)及輪茬玉米(T1)差異不顯著(P>0.05)；在10～20 cm土壤容重苜蓿連種(CK)>輪茬玉米(T1)>輪茬高粱(T2)，輪茬高粱(T2)與苜蓿連種(CK)和輪茬玉米(T1)差異顯著(P<0.05)，苜蓿連種(CK)與輪茬玉米(T1)差異不顯著(P>0.05)；在20～30 cm土層，輪茬玉米(T1)及輪茬高粱(T2)均顯著小于苜蓿連種(CK)(P<0.05)，可以看出輪茬高粱(T2)在降低土壤容重方面表現(xiàn)更為突出，在一定程度上緩解因連種引起的土壤板結(jié)(表3)。

2.4 輪茬作物對(duì)土壤酶活性的影響

從土壤酶活性(表4)可以看出，與連種苜蓿(CK)相比較，輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)土壤堿性磷酸酶的活性差異不顯著(P>0.05)；輪茬玉米(T1)與輪茬高粱(T2)土壤過氧化氫酶活性的值相差不大，分別為173.40和172.03 μmol H2O2·g-1·24 h-1，但均高于苜蓿連種(CK)土壤144.11 μmol H2O2·g-1·24h-1， 且達(dá)到顯著水平(P<0.05)；蔗糖酶在輪茬玉米(T1)土壤中最低，輪茬高粱(T2)與連種苜蓿(CK)差異不顯著(P>0.05)；輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)土壤中脲酶活性分別提高達(dá)到了2385.07及2287.28 μg NH3-N·g-1·24 h-1，均顯著高于連作苜蓿(CK)(P<0.05)。

表3 輪茬作物對(duì)土壤容重的影響Table 3 Bulk density of soil in each treatment (g·cm-3) (mean±SE, n=3)

表4 輪茬作物對(duì)苜蓿土壤酶活性的影響Table 4 Enzyme activities in each treatment (mean±SE, n=3)

2.5 輪茬作物對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

2.5.1不同輪茬作物對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的影響 利用Illumina Miseq分析，檢測(cè)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同輪茬處理下的變化，在不同處理下，變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、厚壁菌(Firmicutes)均為前3位相對(duì)豐度高于10%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門。從連作苜蓿(CK)土壤細(xì)菌組成看，變形菌、擬桿菌、厚壁菌所占比值分別為36.19%、21.06%、13.35%(圖1a)，在輪茬玉米(T1)中所占比值分別為32.10%、19.49%、12.16%(圖1b)；在輪茬高粱(T2)中所占比值分別為27.86%、18.40%、11.02%(圖1c)。在3個(gè)處理中，豐度最高的前3位的細(xì)菌，變形菌相對(duì)豐度CK(36.19%)>T1(32.10%)>T2(27.86%)；擬桿菌相對(duì)豐度CK(21.06%)>T1(19.49%)>T2(18.40%)；厚壁菌 CK(13.35%)>T1(12.16%)>T2(11.02%)。占比最高前3位細(xì)菌相對(duì)豐度均在苜蓿連作(CK)土壤高于輪茬玉米(T1)高于輪茬高粱(T2)，從而可以看出，土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)輪茬高粱(T2)土壤最為穩(wěn)定，輪茬玉米(T1)次之，苜蓿連作(CK)土壤最不穩(wěn)定。

2.5.2不同輪茬作物對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響 9個(gè)土壤樣品中提取DNA，獲得了16S基因的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示總共獲得4675個(gè)細(xì)菌物種OTU(圖2)。連作苜蓿(CK)、輪茬玉米(T1)、輪茬高粱(T2)的16S rDNA個(gè)數(shù)分別為2847、3947、3545，分別代表連作苜蓿(CK)、輪茬玉米(T1)及輪茬高粱(T2)土壤中細(xì)菌物種OTUs；連作苜蓿(CK)專屬物種OTU 198個(gè)，輪茬玉米(T1)專屬物種OTU 310個(gè)，輪茬高粱(T2)專屬物種OTU 677個(gè)；基于平均豐度的輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)共有物種OTU 3015個(gè)，連作苜蓿(CK)和輪茬高粱(T2)之間的共有物種OTU 2429個(gè)，連作苜蓿(CK)和輪茬玉米(T1)的共有物種OTU 2394個(gè)，連作苜蓿(CK)、輪茬高粱(T2)和輪茬玉米(T1)共有物種OTU 2174個(gè)，輪茬高粱(T2)>輪茬玉米(T1)>苜蓿連作(CK)；從而看出，輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)處理根際土壤微生物活性顯著高于連作苜蓿(CK)，物種OTU數(shù)量是連作苜蓿 (CK)的1.25和1.39倍。

2.5.3不同輪茬作物對(duì)根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)特征的影響 輪茬玉米(T1)，輪茬高粱(T2)土壤OTU水平的ACE指數(shù)比苜蓿連作(CK)稍有提高(圖3)，但3者之間的差異不顯著(P>0.05)； Shannon指數(shù)顯示，連作苜蓿(CK)和輪茬玉米(T1)差異不顯著(P>0.05)，而與輪茬高粱(T2)差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)；Sobs指數(shù)顯示，連作苜蓿(CK)和輪茬玉米(T1)差異不顯著(P>0.05)，而與輪茬高粱(T2)差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)；Chao指數(shù)顯示，連作苜蓿(CK)和輪茬玉米(T1)差異不顯著(P>0.05)，而與輪茬高粱(T2)差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)?？梢姡啿绺吡?T2)顯著提高了根際土壤細(xì)菌群落的多樣性。

圖1 不同處理土壤樣品的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Bacteria community of soil samples for different treatments a: CK; b: T1; c: T2; Proteobacteria: 變形菌門; Bacteroidetes: 擬桿菌門; Firmicutes: 厚壁菌門; Candidate_division_SR1: 未分離培養(yǎng)細(xì)菌; Acidobacteria: 酸桿菌門; Chloroflexi: 綠灣菌門; Spirochaetae: 螺旋菌門; Chlorobi: 綠菌門; Nitrospirae: 硝化螺旋菌門; Candidate_division_OD1: 未分離培養(yǎng)細(xì)菌; Planctomycetes: 浮霉菌門; Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門; Unclassified_k_norank_d_Bacteria: 未分類細(xì)菌; Actinobacteria: 放線菌門; WCHB1-60: 未分離培養(yǎng)細(xì)菌; Candidate_division_WS6: 未分離培養(yǎng)細(xì)菌WS6; Candidate_division_TM7: 未分離培養(yǎng)細(xì)菌TM7; Others: 所有相對(duì)豐度低的稀有細(xì)菌門的總和The sum of all rare bacterial phyla with low relative abundances.

2.5.4輪茬作物對(duì)根際土壤細(xì)菌群落豐度的影響 在細(xì)菌門水平，比較了豐度前15的不同細(xì)菌在不同處理下的豐度差別(圖4)。結(jié)果顯示，相較于連作苜蓿(CK)，輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)土壤的變形菌均顯著減小(P<0.01)；而厚壁菌也是在苜蓿連作(CK)土壤中豐度最高，在輪茬玉米(T1)土壤中有所減少，在輪茬高粱(T2)土壤中豐度最低，并且3者之間變化達(dá)到顯著水平(P<0.05)；綠灣菌在苜蓿連作(CK)土壤種相對(duì)豐度最低，在輪茬玉米(T1)土壤中相對(duì)豐度有所增加，在輪茬高粱(T2)土壤中，相對(duì)豐度最大，3者達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)；浮霉菌也是在苜蓿連作土壤中豐度最低，輪茬玉米(T1)土壤中有所增加，而輪茬高粱(T2)土壤中相對(duì)豐度達(dá)到最高值，3者達(dá)到顯著水平(P<0.05)；在豐度最高的前15個(gè)細(xì)菌門，其他細(xì)菌的相對(duì)豐度變化在不同處理下，差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同處理在OTU水平對(duì)土壤細(xì)菌組成的影響Fig.2 Soil bacteria community composition of different treatments on OTU level

圖3 不同處理在OTU水平對(duì)土壤多樣性的影響Fig.3 Soil bacteria composition diversity of different treatments on OTU level *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001. 采用t檢驗(yàn)評(píng)估OTU水平各樣本的細(xì)菌多樣性,下同。The bacterial diversity of each sample on OTU level are estimated by t test, the same below.

圖4 不同處理細(xì)菌相對(duì)豐度(前15個(gè)門)變化Fig.4 Different bacteria abundance based on percentages on phylum level, top 15 phyla

3 討論

3.1 不同輪茬處理對(duì)土壤理化性質(zhì)變化的影響

很多作物都會(huì)表現(xiàn)出連作障礙，尤其豆科牧草，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大的影響。輪作是一種緩解連作障礙的有效措施，能改善土壤健康狀況，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量[12,16,18-19]。以往的研究表明，土壤pH隨著連作時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，土壤修復(fù)能力逐漸降低[20-21]，pH與土壤質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，與土壤健康呈負(fù)相關(guān),與連作和病害呈正相關(guān)[24]。而合理的輪作能夠提高連作土壤的pH，土壤pH和養(yǎng)分含量可通過調(diào)節(jié)土壤的生物學(xué)特性[22]來(lái)調(diào)控長(zhǎng)期種植作物的產(chǎn)量。與之相似，本研究結(jié)果顯示，輪茬使土壤pH有所增加。由于不同作物隨養(yǎng)分的需求消耗并不相同，因而導(dǎo)致土壤殘留養(yǎng)分差異。研究表明，與輪作相比，連作茄子(Solanummelongena)土壤有效磷、鈣、鎂含量顯著降低[16]。土壤有機(jī)質(zhì)也是影響連作土壤質(zhì)量和提高作物抗病性的關(guān)鍵因素。Davis等[25]發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)含量與較大的微生物生物量和較高的作物產(chǎn)量有關(guān)。與苜蓿連作模式相比，苜蓿不同作物輪作處理能夠調(diào)整不同形式碳的含量變化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，輪茬使土壤有機(jī)質(zhì)增加，使得土壤更加肥沃，總氮、速效鉀含量均高于連作土壤,而有效磷含量輪茬高粱低于連作及輪茬玉米土壤，說(shuō)明輪茬高粱后要適當(dāng)增加施磷量。土壤容重能夠反映土壤的通氣性、透水性和植物根系生長(zhǎng)的阻力狀況，其數(shù)值的大小決定于土壤質(zhì)地、結(jié)構(gòu)和松緊程度，是土壤物理性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，土壤容重越小，孔隙度越大，說(shuō)明土壤發(fā)育良好，有利于植物生長(zhǎng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，輪茬在不同根層降低了土壤容重，疏松土壤，更有利于苜蓿的生長(zhǎng)。

3.2 不同輪茬處理對(duì)土壤酶活性大小變化的影響

土壤酶活性是土壤生物化學(xué)過程的重要指標(biāo)[10]，它的大小可以反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的能力，脲酶和堿性磷酸酶參與氮磷循環(huán)和有機(jī)質(zhì)分解[27]，過氧化氫酶是一種可以減輕生物體內(nèi)毒素的氧化還原酶，蔗糖酶能夠催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，進(jìn)而提高土壤生物學(xué)活性，增加土壤營(yíng)養(yǎng)[27]。在棉花、小麥玉米輪作中也發(fā)現(xiàn)輪作能夠提高土壤過氧化氫酶、蔗糖酶及相關(guān)酶活性[28]。10年生苜蓿翻耕后輪作不同作物，結(jié)果顯示輪作土壤酶活性均要高于連作，而且玉米、高粱輪作的土壤酶活性要高于作物連作及谷子(Setariaitalica)、馬鈴薯的輪作方式[18]。與輪作相比，連作茄子土壤多酚氧化酶、脲酶、堿性蛋白酶活性降低，并且不同的輪作方式，土壤酶活性的大小表現(xiàn)不同[16]。本研究表明，土壤脲酶活性在輪茬土壤中顯著高于連作土壤，脲酶可以水解有機(jī)質(zhì)分子中肽鍵，說(shuō)明土壤中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)氮能力。輪茬高粱及玉米均顯著提高了土壤過氧化氫酶活性，說(shuō)明輪茬土壤減輕生物體內(nèi)毒素的氧化還原酶，土壤健康狀況更好。綜上，輪茬處理提高了土壤酶活性，增強(qiáng)了土壤的氧化還原能力，提高了養(yǎng)分的吸收及循環(huán)水平。

3.3 不同輪茬處理對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性變化的影響

細(xì)菌是構(gòu)成土壤微生物最重要的組成部分，微生物群落變化可導(dǎo)致土壤代謝能力和土壤質(zhì)量的變化，是土壤健康的重要決定因素，它們通過影響代謝酶在土壤中的沉積進(jìn)而影響土壤的質(zhì)量和功能[29]，土壤細(xì)菌群落受到農(nóng)業(yè)管理技術(shù)如作物連作和輪作[9,30-31]的影響[19]。同時(shí)，土壤微生物多樣性在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中發(fā)揮著重要作用，因?yàn)槲⑸锟梢杂绊懞芏嗌^程包括植物養(yǎng)分循環(huán)、土壤結(jié)構(gòu)維護(hù)和農(nóng)業(yè)化學(xué)降解，從而促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。通常認(rèn)為：ACE(物種豐富度ACE指數(shù))、Sobs(豐富度實(shí)際觀測(cè)值)、Chao(物種豐富度Chao1指數(shù))指數(shù)反映了群落豐富度(community richness)、Shannon指數(shù)(Shannon多樣性指數(shù))反映了群落多樣性(community diversity)。群落豐富度(community richness)越高，則樣本土壤微生物優(yōu)勢(shì)種群越突出，群落多樣性指數(shù)(Shannon)越低，而多樣性指數(shù)越高，優(yōu)勢(shì)物種豐富度越低，土壤微生物環(huán)境越穩(wěn)定。研究已經(jīng)表明，連作能夠引起根際土壤中微生物群落的重大變化，如果土壤的微生物種群結(jié)構(gòu)失衡，有害微生物會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，形成連作障礙[32]，通過合理輪作，能夠協(xié)調(diào)作物與土壤的關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)及農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的改善，維持農(nóng)業(yè)的可持續(xù)生產(chǎn)。已有報(bào)道表明，輪作可以提高大棚黃瓜土壤的Shannon指數(shù)，輪作土壤中微生物組成及多樣性均要高于連作土壤[19]；10年生苜蓿翻耕后輪作不同作物，結(jié)果顯示輪作土壤微生物數(shù)量顯著高于連作土壤[18]；小麥輪作也能夠顯著提高土壤微生物多樣性[7]；棉花-牧草-冬小麥輪作與棉花連作相比，土壤的微生物量在0～5 cm、5～10 cm、10～20 cm土層均高于連作土壤，而且輪作明顯降低了土壤真菌細(xì)菌比值，提高了土壤質(zhì)量[10]；與輪作相比，連作茄子土壤細(xì)菌分類單元數(shù)量減少，真菌增多，多樣性指數(shù)降低，輪作水稻及四季豆(Phaseolusvulgaris)、長(zhǎng)瓜(Cucurbitaceae)較連作更有利于提高土壤肥力和土地生產(chǎn)力[16]。本研究采用Illumina Miseq測(cè)序法，揭示了連作和輪茬土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果表明，與苜蓿連作(CK)相比，輪茬玉米(T1)和輪茬高粱(T2)，OTU物種數(shù)量明顯增加，土壤細(xì)菌種類更為豐富穩(wěn)定，輪茬高粱(T2)顯著提高了苜蓿根際土壤細(xì)菌群落的Shannon、Chao及Sobs多樣性指數(shù)，這說(shuō)明輪茬高粱后，土壤細(xì)菌群落的數(shù)量、代謝活性及多樣性均升高，土壤活力增強(qiáng)，肥力更高，營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)代謝更為高效，而輪茬玉米雖有提高但差異并不顯著，可能是由于不同輪茬作物根系分泌物的不同影響了土壤細(xì)菌群落多樣性[33]，而連作導(dǎo)致根系分泌物單一，土壤中微生物的代謝結(jié)構(gòu)單一，微生物功能多樣性降低，輪茬能夠優(yōu)化根際土壤環(huán)境，有利于多種微生物的生長(zhǎng)代謝。本研究表明，輪茬高粱的土壤中細(xì)菌豐度及多樣性要高于輪茬玉米，這與虎德鈺等[18]的研究結(jié)果一致，可能是由于高粱吸收肥料水分能力較強(qiáng)，土壤的代謝要高于其他作物，因而土壤微生物數(shù)量要高于其他作物。本研究通過對(duì)不同細(xì)菌豐度分析表明連作及不同作物輪茬對(duì)土壤根際不同細(xì)菌豐度也有不同的影響，所以2種輪茬作物調(diào)控根際土壤微生物群落的機(jī)理各有不同。本研究發(fā)現(xiàn)，變形菌在細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成中，屬于豐度最高的細(xì)菌，一般土壤中變形菌為土壤細(xì)菌豐度最高的細(xì)菌門類[14]，連作土壤中相對(duì)豐度顯著高于輪茬土壤，這可能是因?yàn)檐俎８鼍鷮儆讦?變形菌，因而在苜蓿連作土壤中相對(duì)豐度最高，連作有利于苜蓿土壤中根瘤菌的成長(zhǎng)和積累。有研究表明，隨著黑胡椒(Pipernigrum)連種年限的增加，連作時(shí)間的延長(zhǎng)，厚壁菌相對(duì)豐度逐年降低，而厚壁菌對(duì)土壤病原真菌具有拮抗作用[34]，而本研究中輪茬處理土壤中，厚壁菌相對(duì)豐度低于連作土壤，造成這個(gè)不同的原因可能是作物種類的不同，苜蓿連作可能有利于厚壁菌的積累及生長(zhǎng)。而變形菌及厚壁菌處于表達(dá)豐度最高前3位，連作土壤中高豐度表達(dá)優(yōu)勢(shì)物種也印證了其成為土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定因素。而本研究顯示輪茬處理土壤中綠灣菌相對(duì)豐度顯著高于(P<0.01)連作土壤，而綠灣菌具有生態(tài)恢復(fù)的能力，可以增強(qiáng)土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[35]，可見，輪茬土壤比苜蓿連作，優(yōu)化了根際土壤環(huán)境。浮霉菌和土壤中的硝態(tài)氮的正相關(guān)性，與土壤氮代謝有密切關(guān)系[36]，而本研究顯示，輪茬土壤中浮霉菌相對(duì)豐度顯著高于連作土壤，證明，輪茬土壤更有利于營(yíng)養(yǎng)元素的代謝吸收。綜上，輪茬土壤中細(xì)菌群落多樣性的增加，使土壤菌群更為穩(wěn)定健康，促生菌相對(duì)豐度增加，以及對(duì)有害病菌的拮抗作用增強(qiáng)，對(duì)苜蓿生長(zhǎng)環(huán)境起到了促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

江淮地區(qū)豐富的水熱資源在利于苜蓿生長(zhǎng)的同時(shí)也造成更為嚴(yán)重的連作障礙，不利于農(nóng)業(yè)的產(chǎn)業(yè)化及可持續(xù)化發(fā)展。從以上試驗(yàn)可以看出，輪茬提高了部分土壤酶活性，土壤細(xì)菌多樣性顯著增強(qiáng)，部分功能微生物豐度增加，進(jìn)而使土壤活力增強(qiáng)，微生物代謝增強(qiáng)，功能多樣性增強(qiáng)，促進(jìn)了苜蓿產(chǎn)量。連作3年苜蓿-玉米-苜蓿的輪茬模式能更顯著的提高苜蓿產(chǎn)量，而連作3年苜蓿-高粱-苜蓿的輪茬模式更有利于土壤質(zhì)量的提高，因此，在江淮地區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)化種植區(qū)域，合理輪茬能有效提高牧草產(chǎn)量及土壤質(zhì)量，維持農(nóng)田生產(chǎn)力，提高經(jīng)濟(jì)效益。