胡 貝，李麗霞，李曉健，劉 紅，黃 偉

（湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075）

發(fā)酵豆制品是發(fā)酵食品中的一大類，在亞洲國家人民飲食中占重要地位，其中豆豉、豆醬、醬油和腐乳又被稱為中國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，在我國有深厚的消費基礎[1-2]。隨著發(fā)酵豆制品具有抗氧化、降血壓、降血糖、溶血栓等保健功效被揭示[1，3]，以及人們對食品安全和食品營養(yǎng)的關注度越來越高，保障發(fā)酵豆制品的安全性顯得越發(fā)重要。

脫氫乙酸是繼苯甲酸鈉、尼泊金和山梨酸鉀后的新一代廣譜型食品防腐劑，對霉菌、酵母菌和細菌的抑制能力極強[4-5]。但已有毒理學研究表明，脫氫乙酸會對人體的腎臟、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生慢性影響，并可能引發(fā)癌癥[6]。目前，國標GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[7]中明確規(guī)定了發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的最大使用量為0.3 g/kg。由于發(fā)酵豆制品成分復雜，運用國標方法[8-9]檢測時，前處理方法除雜效果差，色譜分離效果十分不理想，且分析時間長，不利于大批量發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的準確測定。因此，建立適應性更強的檢測方法成為了亟待解決的問題。本實驗從前處理方法（包括蛋白沉淀劑種類、除油脂方法、除鹽方法、提取方法、提取時間、固相萃取小柱種類）和色譜條件（流動相體系）兩方面優(yōu)化了發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測方法，為食品中脫氫乙酸的測定的食品安全國家標準的制修訂和日常監(jiān)督檢測提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆醬：某公司；脫氫乙酸（1 000μg/m L）：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國默克公司；乙酸銨（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硫酸銅、甲酸、乙酸、氨水（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水。CleanertSC18固相萃取小柱（500mg/6m L）：天津博納艾杰爾科技有限公司；Bond ElutC18固相萃取小柱（500mg/6mL）：美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；ST16臺式離心機：德國Thermo FisherScientific公司；LC-250型超聲波清洗器：山東濟寧魯超超聲設備有限公司；VM 24固相萃取儀：天津博納艾杰爾科技有限公司；M illi-Q純水機：德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

脫氫乙酸標準工作溶液：量取適量脫氫乙酸標準儲備溶液，加水定容至刻度，依次配制成質(zhì)量濃度分別為1.0μg/m L、5.0μg/m L、10.0μg/m L、20.0μg/m L、50.0μg/m L的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理方法

提取：稱取約5.0 g均勻樣品于50m L塑料離心管中，加入約10m L水，加入0.2m L亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入0.2m L乙酸鋅，搖勻，用氫氧化鈉溶液（20 g/L）調(diào)pH至7.5，加水稀釋至50m L，搖勻。超聲提取20m in（超聲功率250W），8 000 r/min離心10min，上清液待凈化。

凈化富集：取20m L上清液，用10%的甲酸水溶液調(diào)pH至5.0，定容至25m L，取5m L過已活化的C18固相萃取小柱（依次用5m L甲醇，10m L水活化小柱），用5m L水淋洗，2m L體積分數(shù)為70%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液2m L，渦旋混勻，過0.45μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相為甲醇：0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）=2∶98（V/V），流速1.0m L/min；柱溫30 ℃；進樣量10μL；檢測波長為293 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 蛋白沉淀劑及用量的選擇

根據(jù)國家標準[8-9]、地方標準[10-11]及相關研究[12-19]中所使用的蛋白沉淀劑，選擇了有機沉淀劑（丙酮）、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、硫酸銅和氫氧化鈉與硫酸鋅共4種蛋白沉淀劑進行對比試驗。稱取12份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0 g），分為4組（每組3個平行樣），加標量均為10.0mg/kg，加入蛋白沉淀劑的量分別為丙酮2m L、亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）各2 mL、硫酸銅溶液（100 g/L）和氫氧化鈉溶液（40 g/L）各2m L、硫酸鋅溶液（120 g/L）5mL，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。結(jié)合4種不同沉淀劑的提取效率及沉淀效果，亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）的提取率最高，樣品平均回收率為92.7%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.1%，沉淀蛋白質(zhì)效果最佳。因此，選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為蛋白沉淀劑。

目前通溝污泥的清淤技術已較成熟，主要采用機械清淤與人工清淤相結(jié)合的方式，基本都可以達到有效清淤的目的。當淤積嚴重或者管道坡度太小的情況下，通常采用以下方式進行清淤：（1）采用水力沖刷；（2）在檢查井內(nèi)采用抽吸罐車吸取泥/水混合物。

對亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的加入量進行優(yōu)化，稱取33份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0 g），分為11組（每組3個平行樣），加標量均為10.0mg/kg，分別加入亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）各0.1mL、0.2m L、0.3m L、0.4m L、0.5m L、1.0m L、1.5m l、2.0m L、3.0m L、4.0m L、5.0m L，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）的添加量對脫氫乙酸的加標回收率試驗結(jié)果的影響如表1所示。由表1可知，亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）各加入0.2mL時提取率最高，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.6%。因此，選擇亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和乙酸鋅溶液（220 g/L）的加入量均為0.2m L進行后續(xù)試驗。

表1 亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液的添加量對脫氫乙酸測定的影響Table 1 Effect of potassium ferrocyanide solution and zinc acetate solution addition on the determ ination of dehydroacetic acid

2.1.2 除油脂方法的選擇

稱取12份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0g），分為4組（每組3個平行樣），加標量均為10.0mg/kg，將1.3.2（1）中經(jīng)過超聲提取后的樣液分別采用8 000 r/min離心10min后用注射器吸取上層油脂[20]、依照國標方法[8-9]用正己烷萃取油脂除油、8 000 r/min離心10min和4 000 r/min離心10min共4種不同方法進行除油脂，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。結(jié)果表明，8000 r/min離心10min相較于其他3種除油脂方法不僅無需使用有機試劑、且有較好的除油脂效果，操作簡便、省時省力。因此，選擇8000 r/min離心10min作為最適除油脂方法。

2.1.3 提取方法的選擇

稱取9份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0 g），分為3組（每組3個平行樣），加標量均為10.0mg/kg，分別采用渦旋、超聲、70℃恒溫水浴加熱提取30m in[21]3種不同的提取方式進行提取，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。結(jié)果表明，3種提取方式的提取效率無顯著性差異，超聲提取的樣品回收率較高且省時省力。因此，選擇超聲提取作為最適提取方法。

2.1.4 提取時間的選擇

稱取12份均勻的空白豆醬樣品（每份約5.0g），分為4組（每組3個平行樣），加標量均為10.0mg/kg，設定超聲提取時間分別為10min、20min、30min、40min，其他步驟按1.3.2（1）處理樣品，取上清液過0.45μm有機濾膜，高效液相色譜法測定。不同提取時間對脫氫乙酸的加標回收率試驗結(jié)果的影響如表2所示。結(jié)果表明，20min的提取效果最佳（平均回收率96.2%，RSD為1.9%）。因此，確定最適超聲提取時間為20min。

表2 提取時間對脫氫乙酸測定的影響Table2Effectofextractiontimeondehydroaceticacid determination

由于發(fā)酵豆制品含鹽量高[3]，本實驗選擇了2種固相萃取小柱（分別為BondElutC18柱和CleanertSC18柱）進行除鹽效果對比試驗。BondElutC18柱是強疏水性的鍵合硅膠吸附劑，可用于在離子交換之前去除水相基質(zhì)中的鹽分，鹽能毫無保留地通過吸附劑。CleanertSC18柱是以高純球型硅膠為基質(zhì)的反相C18萃取柱。球型材料均勻度更高，流速更穩(wěn)定，高純的硅膠表面，避免了對堿性與極性物質(zhì)的過度吸附，更適合用于萃取低濃度分析物?？蓱糜跇悠返拿擕}、環(huán)境水樣中的有機物的富集等。

對2種固相萃取小柱分別進行低、中、高濃度（加標量分別為2.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg）的加標回收試驗（每組6個平行樣），按1.3.2處理樣品，脫氫乙酸的加標回收率試驗結(jié)果見表3。由表3可知，使用BondElutC18柱進行凈化，當加標量為2.0mg/kg時，脫氫乙酸的平均回收率僅為74.1%，難以對低濃度的脫氫乙酸進行準確定量。而使用CleanertSC18柱進行凈化，加標量為2.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg時，平均回收率均高于BondElutC18柱，RSD為1.3%～2.9%。當樣品加標量均為5.0mg/kg時，將用國標方法GB5009.121—2016《食品中脫氫乙酸的測定》進行前處理、樣品經(jīng)BondElutC18柱凈化、及樣品經(jīng)CleanertSC18柱凈化后的樣品色譜圖進行對比，結(jié)果見圖1。如圖1所示，樣品經(jīng)CleanertSC18柱凈化后雜質(zhì)更少。因此，試驗選擇CleanertSC18柱。

表3 2種固相萃取小柱的加標回收率試驗結(jié)果（n=6）Table3Resultsofaddingstandardrecoverytestof2typesofsolidphaseextractioncolumn(n=6)

圖1 加標樣品高效液相色譜圖Fig.1HPLCchromatogramsofaddingstandardsamples

2.2 流動相的選擇

國標方法[8-9]中采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨體系作為流動相進行發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測時，使用甲醇-0.02mol/L乙酸銨（10∶90，V/V）洗脫樣品溶液，目標峰（脫氫乙酸）拖尾，雜質(zhì)峰與目標峰之間常常無法實現(xiàn)分離，甚至在40m in附近還有雜質(zhì)峰被洗出，造成分析時間長、效率低下。因此，本研究根據(jù)文獻報道對比了乙腈-0.02mol/L磷酸二氫鉀體系[19-20]、甲醇-0.02mol/L乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5）體系[16]、甲醇-0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）體系[22]共3種體系作為流動相進行等度洗脫，進行發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測，脫氫乙酸標準HPLC色譜圖見圖2。由圖2可知，流動相為甲醇∶0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）=2∶98（V/V）時，相較于乙腈∶0.02mol/L磷酸二氫鉀=35∶65（V/V）、甲醇∶0.02mol/L乙酸銨（用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.5）=40∶60（V/V）兩種流動相體系，目標峰對稱性好，與雜質(zhì)峰分離效果好。因此，選擇甲醇∶0.02mol/L乙酸銨（用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0）=2∶98（V/V）進行洗脫。

圖2 脫氫乙酸標準品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of dehydroacetic acid standard

2.3 線性范圍及檢出限

脫氫乙酸標準工作溶液的質(zhì)量濃度分別為1.0μg/m L、5.0μg/m L、10.0μg/m L、20.0μg/m L、50.0μg/m L，按1.3.3色譜條件進樣分析，以峰面積（y）和脫氫乙酸標準溶液質(zhì)量濃度（x）繪制標準曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 脫氫乙酸標準曲線Fig.3 Standard curve of dehydroacetic acid

由圖3可知，該方法在1～50μg/m L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，標準曲線線性回歸方程為y=25.084x-0.640，相關系數(shù)R2為1.000 0，以3倍信噪比計算檢出限，方法檢出限為1.0mg/kg。

2.4 精密度試驗

以質(zhì)量濃度10.0μg/m L的脫氫乙酸標準工作溶液連續(xù)重復進樣6次進行精密度試驗，分別計算脫氫乙酸的含量并計算相對標準偏差（RSD），結(jié)果見表4。由表4可知，脫氫乙酸的測定結(jié)果的RSD為0.6%，表示該方法精密度良好。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision tests

2.5 加標回收率試驗

稱取空白腐乳、豆醬、豆豉、醬油樣品各18份（每份約5.0 g），將每個品種的發(fā)酵豆制品各分為3組（每組6個平行樣），分別添加適量標準溶液，使3組樣品中脫氫乙酸的加標量分別為2.0mg/kg（低）、5.0mg/kg（中）和10.0mg/kg（高）三個水平，按1.3.2處理樣品進行回收實驗，樣品加標回收率試驗結(jié)果見表5。由表5可知，該方法平均回收率為81.7%～99.1%，RSD為0.6%～2.7%。結(jié)果表明，該方法準確度良好，結(jié)果準確可靠。

表5 加標回收率試驗結(jié)果Table 5 Results of adding standard recovery tests

3 結(jié)論

本試驗對發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的檢測方法的前處理條件及色譜條件進行了優(yōu)化，建立了一種固相萃取-高效液相色譜測定發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的方法，有效的解決了發(fā)酵豆制品中脫氫乙酸的高效凈化富集、液相色譜條件的優(yōu)化、準確定性定量的三大關鍵問題。該方法在1～50μg/m L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)R2＞0.999，方法檢出限為1.0mg/kg，精密度試驗結(jié)果RSD為0.6%，加標回收率為81.7%～99.1%，相對標準偏差（RSD）為0.6%～2.7%。該方法相較于現(xiàn)行國標方法，靈敏度更高、除雜效果明顯，且回收率和重現(xiàn)性良好。不僅有利于延長色譜柱及高效液相色譜儀的使用壽命，還可以為食品中脫氫乙酸測定的食品安全國家標準的制修訂和日常監(jiān)督檢測提供科學依據(jù)。