魯司卿，余晨敏，向 福，2*，熊天涵，曹 城，胡宗濤，周立金

（1.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黃岡師范學(xué)院，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開(kāi)發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

金銀花（Lonicera japonica Thunb），亦稱為雙化、銀花，忍冬等，是一種忍冬科半常綠藤木植物，其性甘寒、氣芳香，在中醫(yī)藥學(xué)中多作為宣散風(fēng)熱、清解血毒等配方，對(duì)治療熱毒瘡癰、咽喉腫痛、發(fā)疹等各種熱性病具有很好的效果[1-2]。

湖北羅田縣位于大別山南麓，具有典型的山地氣候特征，野生金銀花資源豐富，“羅田金銀花”香氣濃郁、揮發(fā)油含量高，2011年獲批中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，且羅田金銀花種植面積已達(dá)2.1萬(wàn)畝，推動(dòng)了地方以金銀花露加工為代表的金銀花產(chǎn)業(yè)發(fā)展[3-5]。金銀花露加工后的蒸餾剩余物中含黃酮、綠原酸等生物活性成分[6]，本地的金銀花加工企業(yè)都面臨蒸餾剩余物資源化利用的問(wèn)題。

現(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤[7-8]、清除自由基[9]、抗突變[10]、抗菌、抗病毒[11]、調(diào)節(jié)免疫、保肝利膽、防治血管硬化[12-13]、降血糖和抗人類疫缺陷病毒（human im munodeficiency virus，HIV）活性[14-15]等功能。近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越關(guān)注微生物轉(zhuǎn)化植物次生代謝產(chǎn)物[16]，其在天然產(chǎn)物和中藥活性物質(zhì)成分的開(kāi)發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用方面應(yīng)用前景廣闊[17-19]。本試驗(yàn)擬以地方企業(yè)加工金銀花露后的蒸餾剩余物為材料，篩選轉(zhuǎn)化總黃酮的微生物并探討其最佳轉(zhuǎn)化工藝條件，從而為地方企業(yè)綜合利用金銀花資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花蒸餾剩余物：湖北楚天舒藥業(yè)有限公司提供，過(guò)濾后濾液備用；枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、黑曲霉（Aspergillusniger）：均由黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）：上海金橞生物科技有限公司；乙醇（分析純）：上海山浦化工有限公司；NaNO2（分析純）、Al（NO3）3（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

察氏培養(yǎng)基[20]：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，蔗糖30g，瓊脂20g，蒸餾水1 L，pH自然，121℃滅菌20m in。

1.2 儀器與設(shè)備

VarianCary100Scan型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；Ax-205METTLERTOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；H/T18MM型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；HYG-B型全溫度搖瓶柜：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；YM 50型不銹鋼立式電熱滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及總黃酮含量測(cè)定

根據(jù)陳瑤等[21-22]報(bào)道的方法，準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.66mg，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液配制成母液，分別取母液0、1.00m L、2.00m L、3.00m L、4.00m L、5.00mL、6.00m L于25m L容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液5.50mL，加入5%亞硝酸鈉1m L后搖勻放置6min，加入10%硝酸鋁溶液1mL之后搖勻放置6min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10m L，并用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液定容至刻度線，放置15m in后，以未加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液的試劑為空白，在波長(zhǎng)509 nm處檢測(cè)其吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，制得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程A=12.197C+0.004 2，R2=0.999 5，蘆丁質(zhì)量濃度在8.6～59.7 μg/m L范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

樣液按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行處理，并在波長(zhǎng)509 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮含量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 菌種篩選

據(jù)刁歡等[23-24]的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉和枯草芽孢桿菌對(duì)總黃酮的轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用，本驗(yàn)試分別在相同的試驗(yàn)條件下測(cè)定其總黃酮增量，篩選出能使發(fā)酵液相比于母液總黃酮增量最高的一種菌用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 總黃酮轉(zhuǎn)化工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

取150m L液體察氏培養(yǎng)基于500m L錐形瓶，滅菌后接入黑曲霉，放入轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床30℃培養(yǎng)3 d左右至長(zhǎng)出菌絲制得黑曲霉菌液。

根據(jù)溶氧量設(shè)定液體發(fā)酵液容器為500m L錐形瓶，總發(fā)酵液體系為150m L：先加入察氏液體培養(yǎng)基30m L和一定體積的蒸餾剩余物液，121℃條件下滅菌20m in，冷卻，按0.92×106CFU/m L接入黑曲霉菌液，蒸餾剩余物液和菌液總體積為120m L。之后放入轉(zhuǎn)速150 r/m in，溫度30℃的搖床培養(yǎng)6 h，離心，測(cè)定總黃酮含量。

根據(jù)樣品液與對(duì)照液（不接菌種，其他條件與樣品液一致）的總黃酮含量，計(jì)算樣品液在菌種發(fā)酵作用下的總黃酮增量。以總黃酮增量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察不同發(fā)酵時(shí)間（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）、接種量（0.61×106CFU/m L、0.92×106CFU/m L、1.23×106CFU/m L、1.38×106CFU/m L、1.47×106CFU/m L）、發(fā)酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）和轉(zhuǎn)速（0、50 r/m in、150 r/m in、200 r/m in、250 r/min）對(duì)總黃酮增量的影響。

1.3.4 總黃酮轉(zhuǎn)化工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)總黃酮增量影響較顯著的發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速這四個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平如表1所示。

表1 總黃酮生物轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for total flavonoids bioconversion process optim ization

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

枯草芽孢桿菌和黑曲霉發(fā)酵金銀花蒸餾剩余物后總黃酮含量變化情況見(jiàn)表2。由表2可知，枯草芽孢桿菌對(duì)總黃酮含量的增加無(wú)效果，而黑曲霉對(duì)總黃酮含量有較明顯作用，總黃酮增加0.32 g/L，因此，轉(zhuǎn)化菌株宜選黑曲霉。

表2 2種菌種對(duì)總黃酮增量的影響Table 2 Effect of two strains on the increment of total flavonoids

2.2 總黃酮生物轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總黃酮增量的影響

由圖1可知，在其他條件相同的情況下，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間從4 h延長(zhǎng)到8 h時(shí)，總黃酮增量增長(zhǎng)緩慢，且發(fā)酵6 h到8 h總黃酮增量無(wú)顯著差異（P＞0.05），發(fā)酵8 h到10 h期間總黃酮增量迅速增加，在10 h時(shí)增量達(dá)到峰值，即0.41 g/L，繼續(xù)增加發(fā)酵時(shí)間，總黃酮增量逐漸降低?？赡苡捎谂囵B(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體數(shù)量過(guò)多，導(dǎo)致菌株?duì)I養(yǎng)和溶氧不足，發(fā)酵轉(zhuǎn)化總黃酮能力下降，故以發(fā)酵時(shí)間10 h為宜。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總黃酮增量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the increment of total flavonoids

2.2.2 接種量對(duì)總黃酮增量的影響

由圖2可知，隨著接種量的逐漸增加，即同等體系下菌液占比的逐漸增加而金銀花蒸餾剩余物液占比的逐漸減少，總黃酮增量呈先升高后降低的趨勢(shì)，總黃酮增量在接種量為1.23×106CFU/m L條件下達(dá)到峰值，為0.44 g/L。繼續(xù)增加接種量，總黃酮增量下降。這主要是由于接種量過(guò)高，黑曲霉菌體生長(zhǎng)迅速，大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，不利于總黃酮的轉(zhuǎn)化。因此，接種量以1.23×106CFU/m L為宜。

圖2 接種量對(duì)總黃酮增量的影響Fig.2 Effect of inoculum on the increment of total flavonoids

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮增量的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮增量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the increment of total flavonoids

溫度可以直接影響著各微生物的生長(zhǎng)、生化反應(yīng)速率及黃酮的提取率、穩(wěn)定性[25]。由圖3可知，發(fā)酵的溫度＜30℃之前，隨著溫度的升高，總黃酮增量逐漸升高，總黃酮增量在30℃的恒溫條件下達(dá)到峰值，為0.50g/L。繼續(xù)升高發(fā)酵溫度至40℃，總黃酮增量隨著發(fā)酵溫度的升高而明顯下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)速度加快，菌體更易衰老，從而影響菌體的生長(zhǎng)最終導(dǎo)致總黃酮增量降低。因此，發(fā)酵溫度以30℃為宜。

2.2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)總黃酮增量的影響

由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，總黃酮增量逐步上升，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加至150 r/min時(shí)總黃酮增量達(dá)到最大，為0.33 g/L。繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，總黃酮增量略有下降。主要是因?yàn)榧羟辛μ髮?dǎo)致菌絲體斷裂從而不利于黑曲霉的生長(zhǎng)，導(dǎo)致總黃酮增量降低。因此，轉(zhuǎn)速以150 r/min為宜。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)總黃酮增量的影響Fig.4 Effect of rotating speed on the increment of total flavonoids

2.3 總黃酮生物轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵時(shí)間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、轉(zhuǎn)速（D）為變量因子，以總黃酮增量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（43）正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 總黃酮生物轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for total flavonoids bioconversion process optim ization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperim ents results

由表3的極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)總黃酮增量的影響次序?yàn)锽＞A＞C＞D，即接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞轉(zhuǎn)速。表4方差分析也表明各個(gè)因素對(duì)總黃酮增量的影響次序是B＞A＞C＞D，但各因素的影響均不顯著（P＞0.05），獲得最佳發(fā)酵工藝條件為A2B1C2D3，即發(fā)酵時(shí)間10 h，接種量0.92×106CFU/m L，發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

最佳發(fā)酵工藝條件，即發(fā)酵時(shí)間10 h，接種量0.92×106CFU/m L，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/m in，為表3中的4號(hào)試驗(yàn)，其總黃酮增量最高；在此條件下平行驗(yàn)證試驗(yàn)3次，總黃酮增量為（2.54±0.48）g/L，與理論值2.51 g/L結(jié)果較一致，表明正交設(shè)計(jì)所確定的黑曲霉發(fā)酵條件為最優(yōu)選。

3 結(jié)論

針對(duì)本地企業(yè)加工金銀花露后的蒸餾剩余物液，利用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉四種微生物進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉能明顯轉(zhuǎn)化提高蒸餾剩余物液中總黃酮含量，為優(yōu)選轉(zhuǎn)化菌株。以總黃酮增量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵工藝為發(fā)酵時(shí)間10h，接種量0.92×106CFU/m L，發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。在此優(yōu)化條件下，黑曲霉轉(zhuǎn)化金銀花蒸餾剩余物中總黃酮增量可高達(dá)（2.54±0.48）g/L。該工藝簡(jiǎn)單有效，適合工業(yè)化生產(chǎn)，從而為地方企業(yè)對(duì)加工金銀花露后的蒸餾殘液進(jìn)行資源化利用提供了依據(jù)。