刁文濤，向凌云，寧 萌，王雪妍，馬 煥，馮 菲，陳國參，周伏忠*

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點實驗室，河南 鄭州 450008）

α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.12）能夠?qū)ⅵ?半乳寡糖、半乳甘露聚糖側(cè)鏈、半乳糖脂和糖蛋白通過α-半乳糖苷鍵連接的非還原端的半乳糖苷殘基逐個水解，釋放出半乳糖[1-2]。該酶在食品、飼料等工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[1]。在制糖工業(yè)中，α-半乳糖苷酶可以分解甜菜漿中的棉籽糖來提高蔗糖的回收率[3]。在飼料工業(yè)中，α-半乳糖苷酶可以分解飼料中的棉籽糖家族寡糖類抗營養(yǎng)物質(zhì)，減少其在單胃動物飼喂中引起的腹脹和腹瀉問題，同時又能提高飼料的利用率[2，4-8]。在造紙工業(yè)中，α-半乳糖苷酶還可以用來提高甘露聚糖酶對紙漿的漂白效果[3，9-10]。

α-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶（glycosidehydrolase，GH），根據(jù)其氨基酸序列的同源性，將其歸入GH 4、GH 27、GH 36、GH 57、GH 97和GH 110家族，其中以GH 27和GH 36家族成員最多。α-半乳糖苷酶在動植物和微生物中廣泛存在[2，11-16]，由于α-半乳糖苷酶的微生物來源最為廣泛，易于基因工程操作，且大規(guī)模生產(chǎn)成本較低，所以得到了更廣泛的關(guān)注[2]。細菌來源的α-半乳糖苷酶大部分歸屬于GH 36家族，能夠水解分子質(zhì)量較小的底物（包括人工合成的對硝基苯基底物和棉籽糖家族寡糖等），最適溫度35℃～90℃各不相同，最適pH值一般在5.5～6.5[17-20]，而真菌來源的α-半乳糖苷酶的最適溫度一般在50～75℃，pH值一般在4.0～5.5[3，21-23]。目前，α-半乳糖苷酶性質(zhì)研究的主要手段是以其基因為出發(fā)點，選擇合適的表達系統(tǒng)，進行酶的異源表達，從而高效、明確地了解α-半乳糖苷酶的分子基礎(chǔ)及酶學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)通過基因工程、蛋白質(zhì)工程等技術(shù)手段對其進行修飾改性，開發(fā)其工業(yè)化應(yīng)用價值，以及相關(guān)酶系的生物信息學(xué)等研究提供理論支持。并且通過異源表達的酶易于特異性純化，避免了從原生菌株中直接分離純化蛋白的復(fù)雜操作。微生物α-半乳糖苷酶異源表達系統(tǒng)一般選用的表達宿主包括大腸埃希菌（Escherichia coli）[22]、巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）[3]以及絲狀真菌如里氏木霉（Trichoderma reesei）等[24]，最高酶活可達1 900U/m L[3]。

本實驗室保存的一株鏈球菌（Streptococcus）S1在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-a-D-galactopyranoside，X-α-gal）的培養(yǎng)平皿上呈現(xiàn)出明顯的藍色，說明其具有α-半乳糖苷酶活性。以該菌株含有的α-半乳糖苷酶基因為目的基因，在大腸桿菌（Escherichia coli）中進行異源表達與重組酶的純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，為尋找更多不同性質(zhì)的α-半乳糖苷酶以適應(yīng)不同的需求奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

鏈球菌（Streptococcus）S1：本實驗室分離保存；E.coli Top10感受態(tài)細胞、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞：全式金生物技術(shù)有限公司。

實驗室改造質(zhì)粒pET-M-3C：通過XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切，并經(jīng)T4 DNA連接酶連接成新片段的方法去除質(zhì)粒pET-32a的S-tag和Trx-tag，并將其thrombin（凝血酶）酶切位點替換為3C酶切位點（L-G-V-L-F-G-P）。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl（分析純）：天津市恒興化學(xué)制造有限公司；鎳-瓊脂糖凝膠、Tris飽和酚：北京索萊寶科技有限公司；對硝基苯（p-nitrophenyl，pNP）（分析純）、對硝基苯-α-D-半乳糖苷（p-nitrophenyl-α-D-galactoside，pNPG）（純度98%）、水蘇糖（純度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蜜二糖（純度99%）、棉籽糖（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；冰醋酸（分析純）、正丁醇（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ：美國賽默飛世爾科技公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度定量試劑盒：北京市普利萊基因技術(shù)有限公司；氯仿、異戊醇（均為分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：美國OMEGA BIO-TEK公司；2Es Taq MasterM ix（Dye）試劑：北京康維世紀生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；NaCl5 g/L，調(diào)pH值至7.4，用去離子水定容至1 000m L，121℃條件下滅菌20min。降至室溫加入氨芐青霉素，質(zhì)量濃度為100μg/m L。

1.2 儀器與設(shè)備

HYG-A恒溫搖床：太倉市豪成實驗儀器制造公司；MULTIFUGEX1R臺式離心機、3001全波長酶標儀：美國賽默飛世爾科技公司；Hema L1低溫連接儀：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；Biometra TProfessional聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司；M ini PROTEAN 3Cell垂直電泳儀、DYCP-31D水平DNA電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 目的基因提取

（1）引物設(shè)計

利用細菌基因組提取試劑盒提取鏈球菌S1的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，以通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，用2Es Taq MasterM ix（Dye）試劑進行PCR擴增（95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30 s，72℃延伸2m in，共30個循環(huán)；72℃再延伸5m in；16℃保溫）獲得16S rDNA，送測序公司測序，測序結(jié)果在https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站與數(shù)據(jù)庫中的已有菌株的16S rDNA進行比較，鑒定菌種。根據(jù)鑒定結(jié)果，在美國國家生物技術(shù)信息中心（national centerofbiotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中找親緣關(guān)系較近菌種中的α-半乳糖苷酶基因序列，利用軟件Primer Premier5設(shè)計引物。

（2）目的基因擴增

以提取的鏈球菌S1基因組DNA為模板，以Sagal-F（5'-AGGGATCCATGGGA ATTCGCATCGAAGG-3'）和Sagal-R（5'-AAACTCGAGTTATTGTTTCACGAAATAG-3'）為引物，用2Es Taq MasterM ix（Dye）試劑進行PCR擴增（95℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2m in，共30個循環(huán)；72℃再延伸5min；16℃保溫），獲得目的基因片段。

1.3.2 基因克隆與載體構(gòu)建

用BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酶內(nèi)切酶分別酶切目的基因片段和載體pET-M-3C，抽提沉淀后用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化到E.coli Top10感受態(tài)細胞中，涂布在加有100μg/m L氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16 h后，挑取單克隆，以Sagal-F和Sagal-R為引物進行菌落PCR篩選陽性克隆，挑取陽性克隆接種至含有100μg/m L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)16 h后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET-M-C-Sagal，送測序公司測序。

1.3.3 蛋白表達與純化

按E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化操作說明書，將質(zhì)粒pET-M-3C-Sagal轉(zhuǎn)化到E.coli BL21感受態(tài)細胞中，涂布在加有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16h后，挑取單克隆接種于5m L LB（含100μg/mL氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)6 h后轉(zhuǎn)接入200m L LB（含100μg/m L氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm值達到0.6左右，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.3mmol/L，16℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。5000 r/min離心15min，收集細胞，用結(jié)合緩沖液（20mmol/L pH 7.9 Tris-HCl；150mmol/LNaCl；10mmol/L咪唑）重懸細胞，超聲破碎（200W、15min）后15 000 r/min離心30min，收集上清液，0.2μm濾膜過濾后，將上清液加入到結(jié)合緩沖液平衡過的鎳柱中（填充物為鎳-瓊脂糖凝膠）結(jié)合10min后，放掉上清，再用結(jié)合緩沖液漂洗柱子3次，之后用洗脫緩沖液（20mmol/L pH 7.9 Tris-HCl；150mmol/LNaCl；300mmol/L咪唑）洗脫，收集洗脫液，采用BCA法測定蛋白含量，每一步采集樣品用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.3.4 pNPG法檢測α-半乳糖苷酶活性

α-半乳糖苷酶酶活測定方法參照文獻[3]進行了部分修改，在相應(yīng)的反應(yīng)溫度預(yù)熱2min后，取100μL待測酶液和100μL的pNPG溶液（10mmol/L）混合，相應(yīng)溫度下反應(yīng)10min，加入800 μL 0.5mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，混勻后取200μL加入到96孔板中，用酶標儀測波長405 nm處吸光度值，代入預(yù)先用對硝基苯（pNP）測定的標準曲線回歸方程，得出α-半乳糖苷酶的活力值。α-半乳糖苷酶酶活定義：一定條件下，每分鐘水解pNPG產(chǎn)生1μmol的pNP所需的酶量定義為1個α-半乳糖苷酶酶活單位（U）。

1.3.5 α-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

（1）最適pH值及pH值耐受性的確定

取不同pH的緩沖液（醋酸鈉緩沖液（pH 3.5～6.0）、磷酸鈉緩沖液（pH 6.5～7.50）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.5～10.5）），在37℃條件下依照1.3.4的方法測定不同pH條件下（終濃度25mmol/L，pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）α-半乳糖苷酶（0.18 μg/m L）催化反應(yīng)的酶活，確定其最適pH值。用不同的緩沖液（終濃度50mmol/L，pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）在冰上預(yù)處理α-半乳糖苷酶1h后測定α-半乳糖苷酶的殘余酶活，確定其耐受pH范圍以最高酶活為100%計算相對酶活。

（2）最適溫度及溫度耐受性的確定

pH 6.5條件下測定α-半乳糖苷酶在35～60℃溫度范圍內(nèi)的酶活，確定其最適反應(yīng)溫度。在0～60℃的溫度范圍內(nèi)預(yù)處理α-半乳糖苷酶1 h后測定其殘余酶活來確定其耐受溫度范圍以最高酶活為100%計算相對酶活。

（3）α-半乳糖苷酶反應(yīng)動力學(xué)

測定α-半乳糖苷酶催化不同濃度pNPG底物濃度（[S]=0.125mmol/L、0.250mmol/L、0.500mmol/L、1.250mmol/L、2.500mmol/L、5.000mmol/L）的水解速率V，以1/[S]（X）為橫坐標，以1/V（Y）為縱坐標制作林-貝氏方程曲線（Y=Km/Vmax·X+1/Vmax），確定α-半乳糖苷酶的酶動力學(xué)數(shù)據(jù)（包括米氏常數(shù)Km和最大催化速率Vmax）。

1.3.6 α-半乳糖苷酶對蜜二糖、棉籽糖和水蘇糖的水解活性

分別配制含有蜜二糖、棉籽糖和水蘇糖的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中含有4mg/m L的糖、10U/m L的重組α-半乳糖苷酶和50mmol/L的pH 6.5的磷酸鈉緩沖液，40℃反應(yīng)，不同時間點（0、5min、15min、30min、1 h）取樣，取出樣品立即煮沸失活。參照文獻中的薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）方法[3]，用層析液（丙醇∶醋酸∶水=1∶1.5∶0.1，V/V）在硅膠層析板上展開樣品（層析兩次），噴灑顯色液（甲醇∶濃硫酸=95∶5，V/V）后，將層析板置于105 ℃烘箱加熱顯色，根據(jù)遷移條帶觀察各寡糖水解情況。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用軟件MEGA6基于16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，使用Excel軟件分析α-半乳糖苷酶酶活數(shù)據(jù)并制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈球菌α-半乳糖苷酶基因Sagal的獲取

采用加X-α-gal的MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈球菌S1，菌落顯示藍色，證明鏈球菌S1具有α-半乳糖苷酶活性。采用軟件Mega7.0構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在鏈球菌范圍內(nèi)基于16SrDNA對菌株S1進行相似性比對，菌株S1與巴黎鏈球菌（Streptococcus lutetiensis）相似性為100%。因此，鏈球菌S1被鑒定為巴黎鏈球菌（Streptococcus lutetiensis）。

圖1 菌株S1基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain S1 based on 16S rDNA sequences

以與鏈球菌S1菌株親緣關(guān)系較近的Streptococcusequinus的α-半乳糖苷酶基因（GenBank：LPVR01000005.1）為模板設(shè)計引物Sagal-F（5'-AGGGATCCATGGGA ATTCGCATC-GAAGG-3'）和Sagal-R（5'-AAACTCGAGTTATTGTTTCACGAAATAG-3'），對鏈球菌菌株S1的基因組進行PCR擴增，獲得了2 200 bp左右大小的DNA片段，如圖2A所示，成功將其構(gòu)建到載體pET-M-3C中。經(jīng)酶切驗證結(jié)果如圖2B所示，經(jīng)測序獲得了該基因片段的DNA序列，如圖3A所示，命名該基因為Sagal。將此鏈球菌S1基因序列與Streptococcus equinus的α-半乳糖苷酶基因（GenBank：LPVR01000005.1）進行相似性比對，顯示有96%的同源性，氨基酸序列比對結(jié)果如圖3B所示，鑒定此序列為一段來自鏈球菌S1的α-半乳糖苷酶基因（分子質(zhì)量：80.4 kDa，等電點：pH 5.25）。

圖2 α-半乳糖苷酶基因PCR擴增產(chǎn)物（A）和質(zhì)粒酶切產(chǎn)物（B）瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.2 Agarose gelelectrophoresis determ ination results of PCR product ofα-galactosidase(A)and plasm id enzyme cutting products(B)

圖3 Sagal基因序列（A）及其蛋白與馬鏈球菌的α-半乳糖苷酶氨基酸序列比對圖（B）Fig.3 Sagal DNA sequence(A)and am ino acid sequence comparison of its protein withα-galactosidase from Streptococcus equinus(B)

2.2 鏈球菌S1α-半乳糖苷酶的表達純化

攜帶質(zhì)粒pET-M-3C-Sagal的重組大腸桿菌BL21（DE3）經(jīng)0.3mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)鎳柱純化的重組鏈球菌S1α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示，可以看到Sagal在大腸桿菌中能夠可溶性大量表達，重組蛋白能夠結(jié)合鎳柱，一步純化后能夠得到純度較高的重組α-半乳糖苷酶，重組α-半乳糖苷酶含量＞100mg/L菌液。

圖4 α-半乳糖苷酶純化結(jié)果Fig.4 Results of purification ofα-galactosidase

2.3 鏈球菌S1α-半乳糖苷酶最適pH值及pH穩(wěn)定性

重組鏈球菌S1α-半乳糖苷酶在不同pH值條件下測定酶活，結(jié)果見圖5。由圖5A可知，37℃條件下，Sagal在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)具有80%以上的活性，pH為8.0時酶活迅速顯著降低至20%以下；在pH 6.5顯示最大酶活，因此該重組酶最適pH值為6.5，是一種酸性α-半乳糖苷酶。由圖5B可知，重組鏈球菌S1α-半乳糖苷酶在pH 7.5～10.5的條件下均比較穩(wěn)定，1 h內(nèi)仍能保留89%以上的活性。

圖5 α-半乳糖苷酶的最適pH值（A）及pH穩(wěn)定性（B）Fig.5 OptimalpH value(A)and pH stability(B)ofα-galactosidase

2.4 鏈球菌S1α-半乳糖苷酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性

重組鏈球菌S1α-半乳糖苷酶在35～60℃反應(yīng)測定酶活，結(jié)果見圖6。由圖6A可知，在40～55℃的溫度范圍內(nèi)具有80%以上的活性，并且溫度為50℃時，α-半乳糖苷酶活性最高。因此，最適反應(yīng)溫度為50℃。由圖6B可知，α-半乳糖苷酶活性在≤40℃條件下處理1h比較穩(wěn)定（酶活均能保持在95%以上），在45℃處理1 h后其酶活僅保留20%以下，說明該α-半乳糖苷酶在45℃以上的高溫環(huán)境中穩(wěn)定性較差，適宜保存在40℃以下的環(huán)境中。

圖6 α-半乳糖苷酶的最適溫度（A）及溫度穩(wěn)定性（B）Fig.6 Optimal temperature(A)and temperature stability(B)of α-galactosidase

2.5 鏈球菌S1α-半乳糖苷酶對幾種天然底物降解能力檢測

由于鏈球菌S1α-半乳糖苷酶在40℃以上溫度條件下不穩(wěn)定，所以為了兼顧酶的穩(wěn)定性與較高的活性，選取在40℃條件下分別以蜜二糖、棉籽糖和水蘇糖作為α-半乳糖苷酶的底物進行反應(yīng)，反應(yīng)過程中不同時間點取樣，樣品立即在100℃加熱失活，薄層層析法檢測α-半乳糖苷酶對以上3種含有α-半乳糖苷鍵的寡糖的水解活性，結(jié)果見圖7。

圖7 薄層色譜檢測α-半乳糖苷酶水解蜜二糖（A）、棉籽糖（B）和水蘇糖（C）的效果Fig.7 Determ ination of hydrolysis effect ofα-galactosidase on melibiose(A),raffinose(B)and stachyose(C)by thin layer chromatography

由圖7可知，隨著水解時間的增加α-半乳糖酶可逐漸水解蜜二糖（圖7A，水解為葡萄糖和半乳糖）、棉籽糖（圖7B，水解為蔗糖和半乳糖）和水蘇糖（圖7C，先水解為棉籽糖和半乳糖，后棉籽糖被進一步水解為蔗糖和半乳糖），1 h內(nèi)所有底物中的α-半乳糖苷鍵基本全部水解，說明該酶可以有效地水解這些α-半乳寡糖，具有應(yīng)用于食品和飼料等工業(yè)中來避免這些α-半乳寡糖所帶來的干擾的價值。

2.6 鏈球菌S1α-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)比較

本文研究了鏈球菌來源的α-半乳糖苷酶的酶活性質(zhì)，其最適pH值為6.5，最適溫度為50℃，且具有較高比酶活，Km也較低，kcat/Km可達567.77 L/（mmol·s）。表1列出了一些來源于真菌和細菌的α-半乳糖苷酶的酶活性質(zhì)，由表1可以看出，這些α-半乳糖苷酶各有特點，鏈球菌S1α-半乳糖苷酶也具有一些自身的特性，在細菌來源的α-半乳糖苷酶中，其催化效率相對較高，而相對于真菌α-半乳糖苷酶，其最適溫度較低，最適pH接近于中性，這些α-半乳糖苷酶相互補充可以適用于不同的需求，結(jié)合開發(fā)使用這些α-半乳糖苷酶可以更加有效地服務(wù)于生產(chǎn)實際需要。

表1 Sagal與一些其他的α-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)比較Table 1 Comparison of enzymatic property of Sagalwith otherα-galactosidases

2.7 鏈球菌S1α-半乳糖苷酶反應(yīng)動力學(xué)

重組鏈球菌S1α-半乳糖苷酶林-貝氏方程曲線如圖8所示。由圖8可知，測得米氏常數(shù)Km為1.20mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為508.38μmol/（min·mg），催化常數(shù)kcat為681.32S-1。

圖8 α-半乳糖苷酶的林-貝氏方程曲線Fig.8 Lineweaver-Burk equation curve ofα-galactosidase

3 結(jié)論

以本實驗室從牛胃溶物中分離保存的一株鏈球菌S1為研究對象，基于16SrDNA的遺傳信息獲得了該菌株α-半乳糖苷酶基因序列，并在大腸桿菌中成功異源表達。通過鎳枉純化了該α-半乳糖苷酶，每升菌液可獲得100mg以上的重組α-半乳糖苷酶，其酶活顯著高于原始菌株。重組α-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)pH值為6.5，最適反應(yīng)溫度為50℃，在堿性環(huán)境中（pH 7.5～10.5）及在40℃以下溫度條件下較為穩(wěn)定，該酶可以有效地水解pNPG，Km為1.20mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax可達到508.38μmol/（min·mg），催化常數(shù)kcat為681.32 S-1，還可以有效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水蘇糖中的α-半乳糖苷鍵，是酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的α-半乳糖苷酶。