楊冬華，趙 璐，綻 麗，劉佳雯，張永棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，青海 西寧 810001)

細(xì)菌生物膜是多個(gè)細(xì)菌細(xì)胞高度組織化后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)系列，細(xì)菌生物膜將細(xì)菌自身包裹其中，使細(xì)菌相互黏連，產(chǎn)生特定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌復(fù)合體,形如膜狀,存在廣泛的多樣性，是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境、維持自身生命所發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化[1-2]。由于形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特征復(fù)雜性程度高，細(xì)菌生物膜一旦附著于生命或無生命表面，很難清除[3-4]。血液透析裝置與供水回路連接的軟管存在難以徹底消毒的缺點(diǎn)，若細(xì)菌超標(biāo)，長(zhǎng)時(shí)間使用可能會(huì)形成生物膜，并可以間斷性地釋放出浮游菌，污染水處理系統(tǒng)。研究[5]顯示，不同的透析方式、透析水質(zhì)量與透析患者微炎癥發(fā)展存在關(guān)系。由于其結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的特殊性，單一消毒劑對(duì)細(xì)菌生物膜的去除效果有限[6-7]。細(xì)菌生物膜的產(chǎn)生是血液透析環(huán)節(jié)中不可忽視的安全隱患。我們對(duì)更換撤下的使用年限為7年的透明聚氯乙烯(PVC)材料、5年不透明聚氯乙烯材料，按照不同的方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行消毒處理，在電鏡下掃描，從形態(tài)學(xué)角度觀察管道內(nèi)表面是否形成細(xì)菌生物膜，以及觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，初步分析水路污染的風(fēng)險(xiǎn)因素，為臨床處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 聚氯乙烯軟管管道標(biāo)本收集：用75%乙醇清潔擦拭與透析機(jī)連接的軟管外部，斷開透析機(jī)與軟管接口處，剪去長(zhǎng)期由金屬卡扣固定部分,收集使用年限為7年、5年的透明和紅色不透明軟管。

1.2 標(biāo)本處理 將PVC軟管加工成1 cm×1 cm的片狀結(jié)構(gòu)，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃锳、B兩組，A組為使用7年的透明軟管，B組為使用5年的紅色不透明軟管，并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)處理。見表1。

表1不同使用年限及軟管材質(zhì)的標(biāo)本處理方式

Table1Processing method for specimens of hoses of diffe-rent service life and material

1.3 掃描電鏡標(biāo)本的制備與檢測(cè) 將標(biāo)本用2.5%戊二醛溶液固定2 h，依次加入70%、80%、90%和100%不同濃度梯度的乙醇中浸泡各30 min，真空干燥機(jī)中無菌風(fēng)干，臨界點(diǎn)干燥，樣本噴金、鍍金膜后在電鏡下掃描觀察。軟管管道樣本掃描電鏡檢測(cè)委托青海省中國(guó)科學(xué)院鹽湖研究所化學(xué)分析測(cè)試中心。

1.4 主要儀器 日立SU8010掃描電鏡，掃描采集圖像倍數(shù)分別為10 000、20 000、30 000、35 000倍，隨機(jī)選取視野。

2 結(jié)果

2.1 使用年限為7年的透明軟管內(nèi)壁細(xì)菌生物膜形成情況 A1組透明軟管電鏡掃描后的成像，圖像顯示有層層疊加、連接網(wǎng)狀的生物膜形成；A2、A3組透明軟管電鏡下掃描成像，顯示細(xì)菌生物膜有縫隙裂縫，未能完全脫落。見圖1。

圖1 電鏡掃描觀察使用年限為7年的透明軟管內(nèi)壁細(xì)菌生物膜形成情況

2.2 使用年限為5年的紅色不透明軟管內(nèi)壁細(xì)菌生物膜形成情況 對(duì)B組紅色不透明軟管進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)本處理后，觀察細(xì)菌生物膜形成情況。B1組紅色不透明軟管電鏡掃描后成像，平面突起的團(tuán)塊即為細(xì)菌生物膜; B2組顯示存在散在的球狀體; B3組顯示存在游離的棒狀細(xì)菌體。見圖2。

圖2 電鏡掃描觀察使用年限為5年的紅色不透明軟管內(nèi)壁細(xì)菌生物膜形成情況

2.3 細(xì)菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu) A組軟管不做任何實(shí)驗(yàn)處理，行不同倍數(shù)電鏡掃描，采集圖像并觀察菌體形態(tài)，顯示主要由成簇生長(zhǎng)的桿菌連接成，連接網(wǎng)狀，層層疊加。見圖3。

圖3 A組軟管不同倍數(shù)電鏡掃描圖

Figure3Electron microscopic scanning with different multiples for group A hoses

3 討論

透析液中若存在細(xì)菌和熱源物質(zhì)等，會(huì)嚴(yán)重威脅透析患者的健康。引起透析液中微生物污染物超標(biāo)的一個(gè)重要原因就是透析用水管路系統(tǒng)中存在細(xì)菌生物膜[8-9]。本研究對(duì)血液透析裝置與供水回路連接使用不同年限、不同材質(zhì)的管路內(nèi)壁進(jìn)行電鏡掃描，圖像顯示有層層疊加、連接網(wǎng)狀的生物膜形成。采用不同倍數(shù)電鏡掃描觀察細(xì)菌生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，顯示主要由成簇生長(zhǎng)的桿菌連接成網(wǎng)狀，結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。細(xì)菌生物膜為平面突起的團(tuán)塊。研究[3, 10-11]顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌會(huì)不斷聚集黏附并趨于成熟，最后形成穩(wěn)固的立體結(jié)構(gòu)。生物膜不斷地釋放游離態(tài)細(xì)菌，存在安全隱患。

如何有效地清除軟管管道的細(xì)菌生物膜，有研究提出更換軟管材料。國(guó)外有研究者開發(fā)出涂覆納米銀薄層的新型硅膠管[12]，對(duì)控制生物膜具有較好的效果。其次最常用的方法為消毒，研究[13]顯示，20種常用消毒劑在0.15%～3.00%的濃度下處理5 min，對(duì)透析系統(tǒng)生物膜中的微生物殺滅效率可達(dá)99.9%。本研究采用常規(guī)消毒方式(即單一過氧化氫消毒劑[7])、消毒劑加機(jī)械清除的方式模擬實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)菌生物膜清除狀況，電鏡掃描結(jié)果顯示，連接成網(wǎng)狀的細(xì)菌生物膜對(duì)消毒劑的抵抗性很強(qiáng)，難以清除。對(duì)A、B組分別進(jìn)行無菌棉拭子攪拌+過氧化氫消毒劑處理，使用年限較短的軟管(B組)細(xì)菌生物膜基本脫落，但存在散在的浮游菌體，而使用年限較長(zhǎng)的軟管(A組)細(xì)菌生物膜仍然未能脫落。王小飛等[14]研究顯示，過氧化氫干霧消毒對(duì)早期生物膜的細(xì)菌有一定作用，對(duì)成熟生物膜無作用。秦亞輝等[15]研究提出，環(huán)氧乙烷與紫外線法消毒對(duì)生物材料表面細(xì)菌生物膜具有清除效果，且消毒時(shí)間越長(zhǎng)效果越好；王若卿等[16]研究顯示，消毒劑對(duì)不同類型微生物生物膜的殺滅率不同，采用高濃度消毒劑消毒并不能完全控制再生水管道生物膜微生物。表明細(xì)菌生物膜的清除效果與其形態(tài)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、疊加程度均存存在很大的關(guān)聯(lián)，需盡早進(jìn)行干預(yù)清除。只有形成“消毒-清洗-除垢”三位一體的策略，多種藥劑和方法共同或輪換使用，才能有效控制其危害，保證透析患者的健康。后期研究將進(jìn)行前瞻性觀察，研究血液透析裝置與供水回路連接的軟管材料、細(xì)菌生物膜形成的時(shí)間點(diǎn)及消毒處理方法等，更好地進(jìn)行水處理系統(tǒng)細(xì)菌生物膜的控制策略性研究。

本研究的創(chuàng)新性為首次在青海地區(qū)三甲醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展透析水路系統(tǒng)的細(xì)菌生物膜研究。局限性為因是初期的探索性研究，結(jié)果部分只是前期摸底的描述性數(shù)據(jù)，近期研究已開展透析水微生物菌落、系統(tǒng)性干預(yù)、方法學(xué)的研究。