黃 震，胥志超，張 波，王紅燕，陳 重，白 冰，潘偉光，李桂秋，徐廣健，余治健，鄧啟文，李多云

(1. 深圳大學醫(yī)學院附屬南山醫(yī)院感染科及內源性感染診治研究重點實驗室，廣東 深圳 518052； 2. 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院肺科門診,廣東 深圳 518101； 3. 深圳市醫(yī)院感染質量控制中心，廣東 深圳 518052)

糞腸球菌是腸球菌最常見的菌種，作為一種條件致病菌可引起泌尿道感染、傷口感染、腹腔內感染、感染性心內膜炎及血流感染等[1]，其耐藥機制復雜且可水平傳播，給醫(yī)院感染控制工作帶來挑戰(zhàn)。糞腸球菌對大環(huán)內酯-林可酰胺-鏈陽霉素B (MLSB)耐藥比較普遍[2-3]，此與甲基化酶改變23S rRNA上的V區(qū)藥物作用靶位(A2058)有關，而最常見的甲基化酶基因為ermB[4-5]。泰利霉素作為酮內酯類抗生素的代表性藥物，是首個獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準進入臨床應用的酮內酯類抗生素[6]，較MLSB多一個作用位點(II區(qū)A752)，其與rRNA結合更牢固，從而抵消部分甲基化酶的作用[7]。目前，國內暫未發(fā)現(xiàn)泰利霉素用于抗臨床分離糞腸球菌研究的相關報道。多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)技術是用于分析細菌系統(tǒng)性進化同源性的重要工具，不同地區(qū)分布的優(yōu)勢ST型不同，其耐藥特性也不同[8]。本研究采用MLST分析糞腸球菌同源性情況，探討不同基因分型的糞腸球菌中ermB基因分布情況及對泰利霉素敏感性的差異，為控制其醫(yī)院傳播提供實驗室依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 菌株及來源 320株糞腸球菌分離自深圳市南山醫(yī)院2010—2016年住院患者臨床標本，標本來源為尿139株(43.4%)，創(chuàng)口分泌物57株(17.8%)，血32株(10.0%)，膽汁27株(8.4%)，其他部位(胸腔積液、腹腔積液、膿液、痰、滲出液、組織塊、引流液、羊水、導管等)共65株(20.3%)。

1.2 菌株鑒定和藥敏試驗 所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃公司)鑒定，采用2016年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法測定所有藥物最低抑菌濃度(MIC)值，主要藥物包括紅霉素、泰利霉素、氨芐西林、萬古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、多西環(huán)素和利福平，以糞腸球菌ATCC 29212作為質控菌株。泰利霉素的折點參考2016年CLSI推薦對金黃色葡萄球菌折點：敏感(≤1 μg/mL)，中介(2 μg/mL)，耐藥(≥4 μg/mL )。

1.3 基因組DNA提取與純化 采用DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒按照革蘭陽性菌操作流程提取細菌基因組DNA，提取的DNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 耐藥基因ermB檢測 耐藥基因ermB引物：erm(B)-F：CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGC；erm(B)-R：GAATCGAGACTTGAG-TGTGC，由北京六合華大基因公司合成。ermB基因PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物(359 bp)于4 ℃保存。產(chǎn)物隨機提取純化后測序，比對后確定為目的基因。

1.5 MLST PCR擴增糞腸球菌7對管家基因(gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yiqL)，其引物、反應體系及反應條件參照MLST網(wǎng)站(http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp)，PCR產(chǎn)物純化后進行測序，測序結果提交MLST網(wǎng)站(http://mlst.net)比對，與數(shù)據(jù)庫中的糞腸球菌相應基因的等位基因進行比較，最終確定糞腸球菌分離株的ST型。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用統(tǒng)計軟件SAS 9.45進行分析，所有耐藥率數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點后一位，統(tǒng)計學處理中耐藥率的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 糞腸球菌的耐藥率 糞腸球菌對泰利霉素中介26株，耐藥138株，耐藥率達51.3%，對紅霉素耐藥率高達95.6%，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=161.92，P<0.001)。見表1。對利奈唑胺、萬古霉素、呋喃妥因、氨芐西林耐藥率分別為15.6%、0.6%、2.2%、0.6%，對多西環(huán)素、利福平及環(huán)丙沙星耐藥率分別為85.9%、95.3%和38.4%。

2.2 MLST及ermB基因的分布 320株糞腸球菌中，207株(64.7%)ermB基因陽性，分為48個ST型，56株菌屬于MLST數(shù)據(jù)庫中未記載的新ST分型(NT)，優(yōu)勢菌株為ST16、ST179和ST30。ST16型 85株(26.6%)，其中72株(84.7%)ermB陽性，對泰利霉素敏感29株(34.1%)，耐藥56株(65.9%)；ST179型80株，其中71株ermB陽性，對泰利霉素敏感15株(18.8%)，耐藥65株(81.3%)；ST30型13株(4.1%)，其中8株ermB陽性，對泰利霉素敏感11株(84.6%)，耐藥2株(15.4%)；其余ST型142株，56株攜帶ermB基因，對泰利霉素耐藥41株(28.9%)。不同MLST糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的MIC值及ermB基因攜帶情況見表2。

表1320株糞腸球菌對泰利霉素及紅霉素的藥敏結果 (株)

Table1Antimicrobial susceptibility of 320 strains ofE.faecalisto telithromycin and erythromycin(No.of isolates)

抗菌藥物SIR泰利霉素15626138紅霉素1456250

S:敏感 I：中介 R：耐藥

表2 不同MLST糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的MIC值及ermB基因攜帶情況

紅霉素折點：S≤0.5 μg/mL，I 1～4 μg/mL，R≥8 μg/mL;泰利霉素折點: S≤1 μg/mL，I 2 μg/mL，R≥4 μg/mL

2.3 不同MLST及是否攜帶ermB基因糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的藥敏結果 比較優(yōu)勢亞型ST16、ST179和ST30型及其他ST型別糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的藥敏結果，經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，不同ST亞型糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的藥敏結果差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表3。ermB陽性的糞腸球菌對紅霉素與泰利霉素的敏感率均低于ermB陰性組(均P<0.001)，見表4。

表3 不同MLST糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的藥敏結果比較

表4 是否攜帶ermB基因糞腸球菌對紅霉素及泰利霉素的藥敏結果比較

3 討論

糞腸球菌是人類腸道常見的共生菌，也是導致各種醫(yī)院感染常見的病原體。糞腸球菌對多種抗菌藥物天然耐藥，且可通過轉座子等獲得耐藥基因，使耐藥屬性在細菌間水平傳播，給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)[9]。隨著大環(huán)內酯藥物在臨床上的廣泛使用，腸球菌屬對大環(huán)內酯類抗生素耐藥較嚴重[9]。世界范圍內已有多項研究將酮內酯泰利霉素用于治療糞腸球菌感染，其效果均優(yōu)于第一、二代大環(huán)內酯類藥物[10-11]。本研究結果顯示，糞腸球菌對泰利霉素總耐藥率達51.3%，高于文獻[10-11]研究，但低于對紅霉素的耐藥率(泰利霉素對糞腸球菌的抗菌效果優(yōu)于紅霉素)。本研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌對常用抗陽性球菌藥物萬古霉素、呋喃妥因、氨芐西林均保持高敏感性，但對利奈唑胺的耐藥性高達15.6%，高于其他研究[12]報道；同時，糞腸球菌對多西環(huán)素、利福平均保持高耐藥性。故臨床上糞腸球菌感染應多選用氨芐西林、萬古霉素、呋喃妥因或利奈唑胺。

采用MLST分析發(fā)現(xiàn)，該院糞腸球菌可分為48個ST型和56株MLST數(shù)據(jù)庫未登記的ST型(NT)，ST16和ST179為絕對優(yōu)勢菌群，其同屬CC16克隆復合群(Clonal complex)，其次為ST30、ST28及ST11等。ST16和ST179較其他ST型對泰利霉素的敏感性亦較差，耐藥率分別達65.9%、81.3%。檢測耐藥基因ermB，發(fā)現(xiàn)在ST16和

ST179型糞腸球菌中ermB基因的陽性率較高，分別為84.7%、88.8%，耐藥基因ermB的存在對降低泰利霉素的敏感性起重要作用。

目前，國內外已有多個報道對臨床及環(huán)境分離的糞腸球菌MLST及特征進行研究。李巖等[13]在遼寧某醫(yī)院分離的優(yōu)勢菌群亦為ST16、ST179，且其毒力基因cylA、gelE、esp和asa1攜帶率在70%以上。研究[14-15]表明，ST16還具有更容易形成強生物膜和更高的特地唑胺(tedizolid)耐藥率等特性。國外糞腸球菌MLST相關研究亦顯示CC2、 CC16、CC21、CC30、CC40及 CC87是世界范圍內播散的優(yōu)勢菌株[16]，上述克隆群在本院亦有發(fā)現(xiàn)，而Ruiz-Garbajosa等研究[17]更是將ST16描述為“適應醫(yī)院的菌群之一”，意味著ST16更容易產(chǎn)生多重耐藥。該院糞腸球菌以ST16和ST179為主，且標本來源以尿、創(chuàng)口分泌物為主，尿路的侵入性操作或導管的使用增加、無菌意識薄弱、傷口處理不當均有導致其流行的可能，在臨床治療中也應根據(jù)CC16的特點合理選用抗菌藥物。

糞腸球菌的耐藥機制復雜，本研究仍存在局限性。erm基因有數(shù)十種亞型，糞腸球菌主要攜帶ermB基因，本研究僅對ermB基因攜帶情況進行研究，亦不排除其他erm基因同時存在并引起泰利霉素耐藥的可能。本院MLST以ST16及ST179分型為主，ermB的高攜帶率僅是紅霉素、泰利霉素高耐藥率機制之一，其他機制仍有待進一步研究。