苗 麗 段 穎 王長林 高 媛 于賢昌,*

(1 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081；2 陜西省漢中市農(nóng)業(yè)技術推廣中心蔬菜食用菌站，陜西 漢中 723000)

黃瓜(CucumissativusL.)是我國重要的瓜類蔬菜作物之一。冬季低溫弱光、夏季高溫強光以及連作導致的土傳病害是限制黃瓜產(chǎn)量的主要因素[1-2]。研究表明，以南瓜為砧木對黃瓜進行嫁接栽培對于提高黃瓜抵御土傳病害和抗非生物脅迫能力具有重要意義。目前用于黃瓜嫁接的南瓜砧木主要包括黑籽南瓜(Cucurbitaficifolia)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)以及某些栽培種之間的雜交種等[3-5]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，中國南瓜(Cucurbitamoschata)砧木種質(zhì)具有抗病性強[6]、提高嫁接黃瓜產(chǎn)量[7]等優(yōu)勢，已成為砧木品種選育的重要方向。

在品種選育中，對砧用南瓜種質(zhì)資源進行較為全面的評價研究，對于優(yōu)異親本的選擇和利用具有重要意義。目前，針對南瓜砧木抗根結(jié)線蟲[6, 8]、枯萎病[9]、極端溫度[10-11]等方面已經(jīng)建立了較為完善的抗性評價體系，但尚缺乏針對嫁接黃瓜產(chǎn)量和風味品質(zhì)多樣性的研究報道。研究表明，黃瓜果實的風味主要由甜度和芳香度組成[12]，其中影響甜度的主要因素為葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖類含量，影響芳香度的主要因素為醛類和醇類等揮發(fā)性物質(zhì)含量[13]，特別是反-2，順-6-壬二烯醛，決定了黃瓜果實的味道和口感[14-15]。盡管南瓜砧木能顯著提高嫁接黃瓜的抗性，但明顯降低了果實的風味品質(zhì)性狀，嚴重影響了抗病性強的砧木種質(zhì)在實際生產(chǎn)中的應用[7]。因此，選育對黃瓜果實風味影響負作用較小的南瓜砧木成為了重要的育種方向。

豐富多樣的種質(zhì)資源是培育優(yōu)異品種的基礎。我國南瓜種質(zhì)資源較為豐富[16-19]，但砧用南瓜品種選育存在遺傳基礎較為狹窄的問題。李鶴等[20]收集了設施黃瓜嫁接栽培中常用的47份砧用南瓜種質(zhì)資源，利用63個形態(tài)學標記和40對南瓜SSR標記進行中國南瓜遺傳多樣性和親緣關系鑒定，發(fā)現(xiàn)85%的品種都聚類于同一類群，說明我國砧用南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性并不豐富，限制了砧用南瓜品種選育工作的發(fā)展。本研究以102份不同遺傳背景的中國南瓜高代純合自交系為砧木，以黃瓜品種新泰密刺為接穗，利用主成分分析和隸屬函數(shù)分析法建立嫁接黃瓜產(chǎn)量和風味的綜合評價體系，以期為豐富中國南瓜砧木資源遺傳背景、篩選高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃瓜嫁接砧木種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

接穗材料為華北地區(qū)黃瓜主栽品種新泰密刺，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所設施栽培課題組提供；砧木材料為來自5個國家及中國16個省(直轄市)和地區(qū)的102份中國南瓜種質(zhì)，均為純合自交系，由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所南瓜育種課題組提供。試驗材料的基本信息詳見表1。

表1 試驗材料及來源地Table 1 Germplasm resources and origins in this study

表1(續(xù))

1.2 試驗方法

試驗于2017年9月-2018年1月在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所南口中試基地日光溫室內(nèi)進行。9月8日催芽南瓜砧木，9月11日催芽新泰密刺黃瓜接穗，選取籽粒飽滿的供試材料種子進行55℃溫湯浸種，并于28℃光照培養(yǎng)箱中催芽，待全部露白時，南瓜播于10 cm×10 cm×9 cm方形營養(yǎng)缽中，黃瓜播于50孔穴盤中。9月18日，當黃瓜子葉完全平展、真葉未露出，并且南瓜子葉完全展平、真葉剛剛露出時，選擇生長健壯、長勢整齊的幼苗采用插接法進行嫁接。用刀片先將南瓜的生長點和真葉去除，在子葉間用嫁接針從一側(cè)子葉向另一側(cè)子葉30°角斜插，深度約0.6 cm，以嫁接針在另一側(cè)子葉中未露出為原則，在接穗子葉下方下胚軸1.5 cm處，切出相同角度的斜切面，將嫁接針從砧木中拔出后，立即插入接穗，并用嫁接夾將其固定。嫁接后置于人工氣候室內(nèi)進行管理，晝溫28～30℃/夜溫18～20℃；嫁接后前2 d避光，再用光強為100～150 μmol·m-2·s-1的弱光照射3～5 d，嫁接后7 d內(nèi)相對濕度維持在95%，7～10 d相對濕度逐步降低至60%；嫁接后4～8 d早晚通風2 h，9～12 d逐漸延長通風時間，直至正常管理。10月18日定植于日光溫室中，行距70 cm，株距35 cm，每個嫁接組合定植8株，對照組為新泰密刺黃瓜自根苗，定植16株。

田間性狀調(diào)查參照《黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[21]進行。11月29日即定植后40 d調(diào)查株高、節(jié)位數(shù)、節(jié)間長、砧木下胚軸直徑、接穗直徑、葉片數(shù)、第一雌花節(jié)位數(shù)、雌花總數(shù)。生長期內(nèi)每7 d采收一次果實并記錄果實數(shù)目和果實質(zhì)量，共采收8次。1月7日采收期結(jié)束后，統(tǒng)計每個嫁接組合所采收的果實總數(shù)目(N)和果實總質(zhì)量(M)，每個嫁接組合的株數(shù)記為n，單果質(zhì)量=M/N，單株產(chǎn)量=M/n；株高利用刻度尺測定；節(jié)間長為植株頂端向下7個節(jié)位的平均長度；砧木下胚軸直徑、接穗直徑利用游標卡尺測定。

果實風味性狀包括果實甜度(Brix%)和風味口感評價2個指標，其中果實甜度用WZ108型手持型糖度計(上海精密科學儀器有限公司)測定；果實風味口感評價參照《黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[21]，并稍作修改：黃瓜表皮洗凈后用水果刀將果實中段橫切成厚約3 cm圓片，請6名從事黃瓜或蔬菜育種研究的專業(yè)工作者通過品嘗或鼻嗅，對嫁接黃瓜商品瓜的口感甜度、脆度、苦味、澀味、芳香氣味進行評價，將風味口感分為4級，并按照0～10分進行打分(表2)，平均值即為果實風味評價值。

表2 黃瓜果實風味口感評價打分標準Table 2 Standard of fruit tasty in grafted cucumber

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Office Excel 2016軟件進行原始數(shù)據(jù)處理，Matlab進行數(shù)據(jù)分析。最大值、最小值、平均值、變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)、多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener index，H′)和隸屬函數(shù)等參照段穎等[22]的方法，采用基于Ward最小化離差平方和法進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嫁接植株13項指標的多樣性分析

對102個嫁接組合和新泰密刺的13個指標多樣性進行統(tǒng)計分析。由表3可知，嫁接黃瓜各項指標表現(xiàn)出較為廣泛的變異，新泰密刺自根苗的各項指標值均介于102個嫁接組合的最大值與最小值之間。13個指標的變異系數(shù)變化范圍為0.10～0.47，單株產(chǎn)量的變異系數(shù)最高(0.47)，其次為果實數(shù)(0.38)；節(jié)間長的變異系數(shù)最低(0.10)，其次為接穗直徑(0.12)、單果質(zhì)量(0.15)、果實甜度(0.15)和口感評價(0.15)。102個嫁接組合中，單株產(chǎn)量在1.50 kg以上的嫁接組合為CN-N20、CN-N32、CN-N41、CN-N65、CN-N67、CN-N78、CN-N82、CN-N91，較對照增產(chǎn)63%～115%。單株產(chǎn)量在0.25 kg以下的嫁接組合為CN-N2、CN-N18、CN-N22、CN-N58、CN-N77，存在不同程度的嫁接不親和現(xiàn)象。13個指標多樣性指數(shù)變化范圍為1.50～2.08，其中果實數(shù)的多樣性指數(shù)最高(2.08)，其次為砧木直徑(2.05)和單株產(chǎn)量(2.03)，果實甜度的多樣性指數(shù)最低(1.50)。綜上，嫁接明顯改變了黃瓜新泰密刺的各項指標，不同砧木對接穗的影響存在較大變異。

表3 嫁接黃瓜13項指標的基本參數(shù)Table 3 Results of basic statistics of 13 traits in grafted cucumber

注：PH：株高；NL：節(jié)間長；StSD：砧木莖粗；ScSD：接穗莖粗；LN：葉片數(shù)；FFN：第一雌花節(jié)位；TFN：雌花總數(shù)；FFR：雌花率；FN：果實數(shù)；FW：單果質(zhì)量；GYP：單株產(chǎn)量；SF：果實甜度；TE：口感評價。下同。

Note: PH：Plant height. NL：Internode length. StSD：Stem diameter of stock. ScSD：Stem diameter of scion. LN: Number of leaves. FFN：Node of first female flowers. TFN：Number of total female flowers. FFR：Female flower ratio. FN：Friut number. FW：Friut weight. GYP：Grain yeild per plant. SF：Sweetness of fruit. TE：Evaluate the taste. The same as following.

2.2 嫁接植株13項指標的相關性分析

由表4可知，在與產(chǎn)量相關的指標中，果實數(shù)與株高、葉片數(shù)相關性較高，分別達到0.849、0.844(P<0.01)，單株產(chǎn)量與株高、葉片數(shù)、果實數(shù)、單果質(zhì)量相關性較高，分別達到0.818、0.841、0.955、0.786(P<0.01)，表明產(chǎn)量相關的各指標之間存在信息重疊。此外，與風味相關的2個指標與其他11個指標之間不存在明顯相關性，需進一步挖掘13項指標之間的深層關系。

表4 嫁接黃瓜13項指標的相關性分析Table 4 Correlation analysis of 13 traits in grafted cucumber

注：*表示在0.05水平上差異顯著;**表示在0.01水平上差異顯著。

Note:*means significant difference at 0.05 level.**means significant difference at 0.01 level.

2.3 主成分分析

對13個指標標準化后進行主成分分析，確定5個綜合指標的累計貢獻率達86.226%，表明5個綜合指標代表了13個指標的大部分信息(表5)。第1主成分的貢獻率為46.739%，其中株高(0.378)、葉片數(shù)(0.374)、果實數(shù)(0.381)、單株產(chǎn)量(0.377)荷載值較高，與植株地上部生長勢和產(chǎn)量密切相關，命名為植株產(chǎn)量因子。第2主成分的貢獻率為17.872%，其中第一雌花節(jié)位數(shù)(-0.555)、雌花率(0.586)荷載值較高，與植株雌花相密切相關，命名為雌花因子。第3主成分的貢獻率為9.214%，其中果實甜度(-0.727)和口感評價(-0.648)荷載值較高，命名為果實風味因子。植株產(chǎn)量因子、雌花因子和果實風味因子的累計貢獻率達到73.825%，充分反映了這3個因子在嫁接黃瓜綜合評價中的重要性。

2.4 隸屬函數(shù)分析

隸屬函數(shù)分析是模糊評價函數(shù)的一種，能對受到多種因素影響的植株性狀指標做出較為全面的評價。由表6可知，102個嫁接組合的隸屬函數(shù)值介于0.14～0.85之間，對照的隸屬函數(shù)值為0.54，排在第78位。隸屬函數(shù)值介于0.75～0.85之間的有7份，分別是CN-N91(0.85)、CN-N67(0.82)、CN-N20(0.78)、CN-N78(0.78)、CN-N32(0.77)、CN-N52(0.76)、CN-N82(0.76)，這些材料在田間生長、產(chǎn)量和風味評價上都表現(xiàn)出很強的優(yōu)勢。隸屬函數(shù)值介于0.60～0.75之間的嫁接組合有46份，與對照相比，這些嫁接組合的田間綜合表現(xiàn)較好。隸屬函數(shù)值介于0.45～0.60的嫁接組合有40份，田間表現(xiàn)與對照較為接近。隸屬函數(shù)值介于0.14～0.45之間的嫁接組合有9份，其中低于0.40的嫁接組合是CN-N18(0.39)、CN-N22(0.38)、CN-N99(0.37)、CN-N58(0.32)、CN-N2(0.14)，田間表現(xiàn)為嫁接親和性低、雌花率低，不適合作為新泰密刺的砧木。

2.5 聚類分析

采用最小化離差平方和法進行系統(tǒng)聚類分析，以反映不同嫁接組合田間表現(xiàn)及果實性狀的差異，并構建樹狀圖將田間表現(xiàn)相似的劃歸為一類。由圖1可知，102個嫁接組合和對照新泰密刺自根苗可分為4個類群。第1類群共27份嫁接組合，田間表現(xiàn)各方面均優(yōu)于對照，其中包括火鳳凰(N7和N9，泰國)、三禾(N89和N91，甘肅)、白籽南瓜(N17和N19，遼寧)等常見優(yōu)質(zhì)砧木種質(zhì)，同時還挖掘出一批具有較高砧用潛力的種質(zhì)，如柿餅南瓜(N65和N67，陜西)、牛腿南瓜(N78、N80、N82，陜西)，這些嫁接組合的隸屬函數(shù)值甚至高于常用砧木嫁接組合，在提高新泰密刺產(chǎn)量和果實風味品質(zhì)等方面具有很高的育種價值。第2類群共22份嫁接組合，田間表現(xiàn)為一定程度地提高了新泰密刺的產(chǎn)量和風味，其中包括4份源自日本的砧木種質(zhì)，分別為日本南瓜(N12、N13、N14，日本)和はゃと(N16，日本)，以及2份牛腿南瓜(N79和N81，陜西)。日本南瓜P1-2-20150644(N14，日本)和JK砧木(N30，山東)不僅在產(chǎn)量和風味評價上表現(xiàn)優(yōu)良，并且還表現(xiàn)出很強的去蠟粉能力，兼具黃瓜果實外觀品質(zhì)改良潛力，值得進一步評價其在抗病、抗蟲、耐逆境、去蠟粉能力上的表現(xiàn)。第3類群共45份嫁接組合，田間表現(xiàn)與對照較為接近，CK-N8、CK-N51、CK-N92這3份嫁接組合的果實口感在102個嫁接組合中評價最高，分別為6.0、6.2、6.2，較對照分別提高11%、15%、15%，具有改善嫁接黃瓜口感的潛力。第4類群共8份嫁接組合，其隸屬函數(shù)值介于0.14～0.40之間，其中黃油南瓜(N2，澳大利亞)表現(xiàn)為明顯的嫁接不親合性，株高僅為平均株高的35%(表3)，雌花率僅為平均雌花率的18%。這些種質(zhì)可作為葫蘆科蔬菜嫁接親和性研究的試驗材料。

表5 嫁接黃瓜13項指標的主成分分析Table 5 Principal component analysis of 13 traits in grafted cucumber

3 討論

3.1 嫁接對黃瓜商品瓜產(chǎn)量的影響

黃瓜商品瓜果實的產(chǎn)量和風味是黃瓜經(jīng)典遺傳育種所關注的重要性狀。前人研究表明，全雌性黃瓜產(chǎn)量與單果質(zhì)量、果實數(shù)、株高具有極顯著相關性[23]。利用南瓜砧木對黃瓜進行嫁接后，嫁接苗在田間生長表現(xiàn)、果實相關性狀以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等方面均發(fā)生了較明顯的變化[24-25]。本研究通過相關性分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜接穗的雌花始花節(jié)位數(shù)及雌花數(shù)量受到不同南瓜砧木遺傳背景的影響。已有研究表明，嫁接可改變接穗中miRNA的表達水平，且SiRNA作為長距離信號在接穗中特異性誘導下游基因的轉(zhuǎn)錄后沉默[26]。以南瓜為砧木進行黃瓜嫁接時，黃瓜接穗中與開花相關基因受到miRNA調(diào)控，特別是miR156/157、miR159、miR167、miR172等miRNA水平，抑制下游基因SBP、ARF8、AP2等開花相關基因表達，從而影響嫁接苗從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變[27-29]。本研究中，黃瓜新泰密刺自根苗第一雌花節(jié)位為4.30，雌花率為0.21，而南瓜砧木嫁接后的第一雌花節(jié)位在4.20～9.80之間，雌花率在0.04～0.41之間，總體上南瓜砧木對開花時間表現(xiàn)出一定的延遲作用，且這種作用因砧木種質(zhì)而異，其具體機制有待進一步研究。

3.2 嫁接對黃瓜商品瓜風味品質(zhì)的影響

黃瓜商品瓜風味與醛類、醇類等揮發(fā)性代謝物質(zhì)含量有關，也與可溶性糖、可溶性蛋白、有機酸、游離氨基酸、丹寧等含量密切相關。嫁接黃瓜果實風味的相關研究普遍表明，南瓜砧木對嫁接黃瓜果實風味具有負面作用。董邵云等[14]以2個南瓜砧木品種和2個黃瓜接穗品種為試驗材料，發(fā)現(xiàn)嫁接導致果實中風味和口感均有所下降，果實中乙醛、反-2-庚烯醛等揮發(fā)性物質(zhì)含量升高。李紅麗等[30]研究表明，嫁接會降低可溶性糖含量，提高單寧含量，從而降低果實甜度，提高澀度。此外，嫁接導致酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AI)、中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase，NI)以及磷酸蔗糖合成酶(phosphate sucrose synthase，SPS)等參與糖代謝的酶活力均有所提高[31]。轉(zhuǎn)錄組分析表明，不同砧木的嫁接顯著影響接穗中糖酵解、果糖代謝、α-亞麻酸代謝有關基因的表達，從而改變了嫁接黃瓜的風味品質(zhì)[32]，但具體調(diào)控機制尚不明確。本研究進一步明確了南瓜砧木對黃瓜果實品質(zhì)性狀的負面影響，同時從102份種質(zhì)中還鑒定出火鳳凰2-20150629(N8，泰國)、無蔓南瓜-20150689(N51，山西)和冠龍(N92，新疆維吾爾自治區(qū))等3份中國南瓜種質(zhì)，其嫁接黃瓜風味評價較對照提高10%～15%，將這些種質(zhì)的優(yōu)良性狀加以聚合利用，可望改良嫁接黃瓜普遍存在的風味口感不佳等問題。此外，利用風味性狀差異較為顯著的種質(zhì)作為親本，通過構建遺傳連鎖圖譜對QTL位點進行定位分析和分子標記輔助育種，將有助于進一步提高優(yōu)質(zhì)砧用南瓜品種的選育效率。

3.3 綜合評價體系在砧用南瓜品種選育工作的指導應用

本研究通過主成分分析和隸屬函數(shù)分析，將102份嫁接組合的13個性狀指標進行降維優(yōu)化，消除了各指標之間的相關性，較為客觀地評價了種質(zhì)的田間綜合表現(xiàn)，將102份中國南瓜砧木種質(zhì)聚為4個類群。在產(chǎn)量和風味評價較好的第1類群中，鑒定出白籽南瓜(N17和N19，遼寧)、火鳳凰(N7和N9，泰國)等4份生產(chǎn)上常見的砧木種質(zhì)，說明該評價體系對中國南瓜砧用性狀的評價較為客觀，對于種質(zhì)篩選具有一定的田間指導意義。最終，從102份中國南瓜種質(zhì)中鑒定出7份表現(xiàn)較為突出的種質(zhì)，其中包括現(xiàn)有砧木品種中不太常見的牛腿南瓜、柿餅南瓜以及幾份源自俄羅斯和日本的優(yōu)良種質(zhì)，對于改善我國砧木種質(zhì)資源遺傳背景狹窄的現(xiàn)狀起到了一定的作用。特別是柿餅南瓜5Bb636-3(N67)和三禾13-s08z13-3(N91)2份種質(zhì)，其嫁接組合在產(chǎn)量和風味評價均較出色。第4類群共有8份種質(zhì)，均對新泰密刺的嫁接親和性表現(xiàn)出不同程度的降低，嚴重影響了嫁接黃瓜的生長和后期產(chǎn)量，這些種質(zhì)資源為嫁接親和性機制的研究提供了合適的材料。

圖1 102份中國南瓜種質(zhì)資源聚類圖Fig.1 Dendrogram of 102 Cucurbita moschata germplasms derived from clustering analysis

綜上所述，本研究利用所建立的綜合評價體系，篩選獲得了一批在產(chǎn)量和風味品質(zhì)方面表現(xiàn)較為突出的種質(zhì)，這對于改良中國南瓜砧用性狀、提高嫁接黃瓜果實品質(zhì)具有很高的應用價值，同時獲得了一批試驗材料可以用于砧木嫁接親和性和風味品質(zhì)形成機制研究。下一步將繼續(xù)對該評價體系進行優(yōu)化，并對優(yōu)質(zhì)種質(zhì)進行抗病性評價和果實外觀品質(zhì)的評價研究，以期進一步闡明嫁接品質(zhì)形成機制，為優(yōu)良砧木品種創(chuàng)制和分子改良育種奠定基礎。

4 結(jié)論

本研究對中國南瓜高代自交系種質(zhì)與黃瓜新泰密刺的嫁接組合進行果實產(chǎn)量和風味的綜合評價，通過主成分、隸屬函數(shù)和聚類分析，初步建立了中國南瓜砧木對黃瓜商品瓜產(chǎn)量和風味品質(zhì)育種的篩選鑒定體系。結(jié)果表明，以中國南瓜為砧木的嫁接黃瓜在苗期、商品瓜果實產(chǎn)量和風味等性狀表現(xiàn)出較為豐富的多樣性，利用綜合評價體系將102份中國南瓜砧木種質(zhì)資源分為4個類群，篩選獲得了牛腿南瓜、柿餅南瓜等7份綜合表現(xiàn)較好的種質(zhì)，為豐富中國南瓜優(yōu)良砧木品種選育提供了理論依據(jù)。