韓雯毓 李國瑞 風 蘭 閆星伊白英俊 李孟建 孫佳欣 陳永勝,2,*

(1 內(nèi)蒙古民族大學，內(nèi)蒙古自治區(qū) 通遼 028000；2 內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心/ 內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點實驗室/內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 通遼 028000)

WOX(WUSCHEL-related home-obox)轉(zhuǎn)錄因子是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長發(fā)育和應激反應具有重要作用[1]。WOX蛋白來自Homepbox(HOX)超家族，其具有由60～65個氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)(T-L-X-L-F-P-X-X，其中X代表任一氨基酸)的保守結(jié)構(gòu)域。WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中廣泛存在，目前已在擬南芥、水稻、玉米等[1]植物中得到鑒定。研究表明WOX轉(zhuǎn)錄因子與植物器官形成、干細胞分裂、胚胎發(fā)育等生命進程密切相關(guān)[2]。WOX家族可分為三個獨立的進化支，即現(xiàn)代進化支(Modern clade)、中間進化支(Intermediate clade)和古代進化支(Ancient clade)。研究表明，擬南芥AtWOX1與AtWOX3可以調(diào)控葉片發(fā)育過程中側(cè)生組織的發(fā)育，AtWOX9可以維持分生細胞的生長和分裂[3]；AtWOX14和AtWOX4可調(diào)節(jié)形成層和原形成層分生組織的分化[4-5]。

蓖麻(RicinuscommunisL.)為大戟科一年生或多年生草本植物[6]，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥及紡織等領域具有較高的應用價值與經(jīng)濟價值[7-8]，也是可再生生物能源的優(yōu)質(zhì)材料[9]。大部分石油產(chǎn)品均可由蓖麻油及其洐生物制備而獲得，被人們譽為極具開發(fā)潛力又可再生的“綠色石油”[10]。隨著耕地的減少、世界能源的日益緊缺，蓖麻作為唯一可替代石油的農(nóng)作物產(chǎn)品，遺傳改良其重要農(nóng)藝性狀和培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的抗逆品種是實現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)的重要方法[11]。盡管目前在擬南芥、水稻等模式植物中已有關(guān)于WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在系統(tǒng)發(fā)育規(guī)模及其功能的研究報道，但關(guān)于蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族全面的分子進化研究尚鮮見報道。

本研究利用生物信息學技術(shù)手段對蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族進行預測，分析其蛋白保守結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、家族進化及其在干旱與鹽脅迫下根、莖、葉不同組織的表達模式，旨在更好地了解WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在蓖麻中的進化歷史與多樣性，為蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在逆境響應中的功能研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蓖麻植株材料由內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市農(nóng)業(yè)科學研究院提供，基因組文件下載自蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫(http://castorbean.Jcvi.org/index.php)。擬南芥WOX轉(zhuǎn)錄因子序列下載自TAIR(http://www. Arabidopsis.org/)。水稻W(wǎng)OX轉(zhuǎn)錄因子序列下載自PlantTFDB (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)。

1.2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與理化性質(zhì)分析

通過蓖麻基因組文件構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，WOX隱馬爾科夫模型(PF00046)下載自Pfam[12](http://pfam.xfam.org)。采用HMMER提取蓖麻基因組中的WOX蛋白序列，將所得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，去除冗余序列。為確保序列準確性，將含有WOX結(jié)構(gòu)域的序列提交至SMART再次進行鑒定[13]。最后將含有WOX結(jié)構(gòu)域的序列在PlantTFDB中進行比對與分析，進一步鑒定其是否屬于蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族。利用ExPASy Proteomics (http://web.expasy.org/compute_pi)在線工具對WOX家族成員進行理化性質(zhì)分析[14]。

1.3 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育分析

將蓖麻WOX蛋白分別命名為RcWOX1～RcWOX11，通過ClustalW將擬南芥、水稻與蓖麻的WOX蛋白序列進行比對[15-16]；利用MEGA7.0進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap參數(shù)設置為1 000，其他為默認參數(shù)。

1.4 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

利用在線軟件GSDS (Gene Structure Display Server 2.0 http://gsds.cbi.pku.edu.cn)與MEME5.2(http://meme-suite.org)進行基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析[17]。

1.5 前處理試驗

以蓖麻2129品系為試驗材料，采用盆栽法，待蓖麻長出4片真葉后，選取長勢一致的植株進行處理。干旱脅迫組采用霍格蘭營養(yǎng)液+30%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)處理；鹽脅迫組采用霍格蘭營養(yǎng)液+0.2 mol·L-1NaCl進行處理；對照組采用等體積的霍格蘭營養(yǎng)液澆灌。在處理0、3、6、9、12、24 h后采集根、莖、葉樣品，立即液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蓖麻WOX家族基因的表達分析

按照RNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)說明書提取蓖麻根、莖、葉RNA，逆轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒[TaKaRa(日本)公司]說明書進行，實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑[TaKaRa(日本)公司]在7500熒光定量PCR儀(北京賽默飛世爾有限公司)上完成，以蓖麻18S為內(nèi)參基因，引物序列詳見表1。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計數(shù)據(jù)；利用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定及其理化性質(zhì)分析

利用HMMER軟件提取蓖麻WOX蛋白序列，利用Pfam和SMART確定含有WOX結(jié)構(gòu)域的蛋白，去除冗余序列后，將序列與PlantTFDB中WOX轉(zhuǎn)錄因子進行比對，最后鑒定到具有典型WOX結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族成員共11個，分別將其命名為RcWOX1～RcWOX11。由表2可知，RcWOX6蛋白序列最長(401 aa)，分子量也最大，RcWOX1蛋白序列最短(163 aa)；等電點為5.35～10.00，其中55%為堿性蛋白質(zhì)。推測的蛋白分子量為19 451.27～45 168.8 kDa，脂肪族氨基酸指數(shù)為44.34～82.02。蓖麻WOX家族蛋白質(zhì)的親水性平均值為-0.429～-1.163，說明其均為親水蛋白質(zhì)，但在親水程度上存在差異。

表2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族成員的鑒定及特征Table 2 Characteristics and identification of WOX transcription factors in castor

2.2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為揭示蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族的進化關(guān)系，以擬南芥與水稻的WOX轉(zhuǎn)錄家族成員為參考，對鑒定的11個含有蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族成員的同源異型結(jié)構(gòu)域序列進行比對，使用MEGA7.0進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)擬南芥與水稻中的報道，WOX蛋白分為三個亞家族，分別為古代進化支、中間進化支與現(xiàn)代進化支。由圖1可知，在蓖麻RcWOX蛋白家族中，古代進化支與中間進化支各有2名成員，分別為RcWOX10、RcWOX11與RcWOX7、RcWOX9，現(xiàn)代進化支包括RcWOX1、RcWOX2、RcWOX3、RcWOX4、RcWOX5、RcWOX6及RcWOX8共7名成員。

圖1 蓖麻與擬南芥WOX轉(zhuǎn)錄因子家族進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of WOX gene family in castor and Arabidopsis thaliana

2.3 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

由圖2可知，同一進化支內(nèi)成員的基因結(jié)構(gòu)均較保守，且內(nèi)含子、外顯子數(shù)存在差異。RcWOX9、RcWOX11、RcWOX6分別含有2、3、4個外顯子，表明WOX基因功能的多樣性可能是由于基因家族進化過程中外顯子的丟失或增加導致的。對5個保守基序進行分析發(fā)現(xiàn)，不同成員均含有約65個氨基酸殘基組成的同源異型結(jié)構(gòu)域，且不同分支的保守結(jié)構(gòu)域與基因結(jié)構(gòu)的數(shù)、種類均具有高度一致性，即系統(tǒng)發(fā)育分析可靠性較高。但對一些分支，有些基序是獨特存在的，如基序4是古老進化支特有的，基序3是中間進化支特有的，從某種程度上講，這些基序可能對進化支起重要作用，且對基因功能的多樣性也具有一定作用。

圖2 蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Gene structure and conserved motif of WOX transcription factors in castor

2.4 蓖麻WOX基因在干旱脅迫下的表達模式分析

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果選取古代進化支成員RcWOX9，中間進化支成員RcWOX10與現(xiàn)代進化支成員RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8共5個基因檢測其在30% PEG處理下不同時間RNA水平上的表達情況。由圖3可知，5個基因在3種組織中均有表達，且在不同組織中的表達模式存在差異性。在未脅迫處理下，5個基因均在根中相對表達量最高，且RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX10在根、莖、葉中的相對表達量依次表現(xiàn)為根>莖>葉；RcWOX9在莖中相對表達量最低。干旱脅迫誘導RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9表達，處理時間3 h時RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中相對表達量迅速上調(diào)；RcWOX2在處理9 h內(nèi)莖中的相對表達量持續(xù)上調(diào)，之后隨著脅迫處理時間的增加持續(xù)下調(diào)。干旱脅迫抑制RcWOX10的表達，隨著脅迫處理時間的增加，其在根中的相對表達量呈下調(diào)趨勢。

圖3 干旱處理下蓖麻RcWOX基因的表達水平Fig.3 Expression level of RcWOX genes under drought treatments

圖4 鹽處理下蓖麻RcWOX基因的表達水平Fig.4 Expression level of RcWOX genes under salt treatments

2.5 蓖麻WOX基因在鹽脅迫下的表達分析

由圖4可知，在鹽脅迫下，5個基因均被誘導表達，不同脅迫處理時間下根中RcWOX2和RcWOX9的相對表達量均高于莖和葉，且根中RcWOX2的相對表達量隨著脅迫處理時間的增加持續(xù)上調(diào)；隨著脅迫處理時間的增加，RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中的相對表達量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，RcWOX10則在鹽脅迫處理后的9 h內(nèi)急劇下降，之后又呈升高的趨勢。

3 討論

全基因組分析已成為研究某些物種的基因家族最基礎的工具[18]。WOX轉(zhuǎn)錄因子作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長發(fā)育以及應激反應具有重要作用[19]。AtWUS是擬南芥WOX家族轉(zhuǎn)錄因子中最早被鑒定的成員，Haecker[20]利用WUS同源異型盒進行同源搜索得到14個編碼WUS同源異型盒開放閱讀框，將與WUS同源異型結(jié)構(gòu)域具有38%～67%一致性和62%～87%相似性的蛋白命名為WOX蛋白家族，并將其根據(jù)進化樹分為古代進化支、中間進化支與現(xiàn)代進化支三個進化支。本研究從蓖麻基因組中鑒定出11個WOX成員，在古代進化支、中間進化支和現(xiàn)在進化支分別有2、2和7個成員，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與擬南芥[21]、番茄[22]、水稻[23]等模式植物類似。對不同成員理化性質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)不同蛋白之間均存在差異。其中RcWOX6和RcWOX7是由同一基因LOC8286328編碼而成，這可能是由RNA的選擇性剪接造成[24]。研究表明，WOX轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物分生組織的調(diào)控。現(xiàn)代進化支的成員AtWUS和AtWOX5可以在根尖分生組織中維持干細胞穩(wěn)定性[25]；在中間進化支中，AtWOX11在形成層中特異性表達，可促進不定根的形成[26]。在古代進化枝中，AtWOX13可促進果實的胚胎發(fā)育[27]。不同物種進化支的緊密聚類表明其具有共同的起源，從直系同源基因的進化結(jié)果來看，RcWOX10可能與果實胚胎發(fā)育有關(guān)[28-29]，蓖麻RcWOX4可能參與根的生長與發(fā)育[30]，推測其可能在根的干旱與鹽脅迫響應方面具有重要作用。

已有研究表明，干旱處理下，幾乎所有水稻OsWOXs基因在處理12 h時均被誘導上調(diào)表達。鹽脅迫能誘導OsWOX3和OsWOX5上調(diào)表達[31]。本研究中，干旱脅迫誘導RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9的表達，當處理時間達3 h時RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中表達量迅速上調(diào)，說明這些基因能在干旱脅迫中快速響應。鹽脅迫下，5個基因均被誘導表達，RcWOX2在根中的表達量隨著脅迫處理時間的增加持續(xù)上調(diào)，說明逆境脅迫誘導該基因表達；隨著脅迫處理時間的增加，RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9在根中的表達量均呈先上升后降低的趨勢；RcWOX10則在鹽脅迫處理后的9 h內(nèi)急劇下降，之后又恢復并呈升高趨勢，推測其可能參與了脅迫后期的修復過程[32]，表明RcWOX2、RcWOX4、RcWOX8、RcWOX9、RcWOX10基因在蓖麻抗鹽脅迫中具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究從蓖麻基因組數(shù)據(jù)中鑒定并獲得11個WOX轉(zhuǎn)錄因子，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，蓖麻RcWOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為三個分支，在古代進化支、中間進化支和現(xiàn)在進化支分別有2、2和7個成員；5個RcWOXs基因除RcWOX10受干旱脅迫抑制，其余基因在干旱和鹽脅迫下均被誘導表達，表明WOX類轉(zhuǎn)錄因子可能對蓖麻逆境脅迫應答反應起調(diào)控作用。本試驗結(jié)果為進一步研究蓖麻WOX轉(zhuǎn)錄因子家族在逆境脅迫中的功能提供了理論參考。