劉 艷 黃傳書(shū) 趙 珮 雷 霆 宋志光 邢康康

(1.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶400700；2.重慶市中藥研究院，重慶400065)

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，作為中藥入藥已有2000多年的歷史，在《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》《中藥大辭典》中均有詳細(xì)記載，是中國(guó)最有發(fā)展前景的藥用真菌之一，有“森林黃金”之美稱(chēng)[1]。現(xiàn)代研究表明，桑黃具有抗癌、抗腫瘤、保肝、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用。桑黃因其多糖能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，且對(duì)人體不良反應(yīng)小，是目前國(guó)際公認(rèn)的生物治癌領(lǐng)域中效率最高的真菌。目前桑黃菌種包括鮑氏針層孔菌(phellinusbaumii)、火木針層孔菌(phellinusigniarius)、裂蹄針層孔菌(phellinuslinteus)、瓦寧纖孔菌(Inonotusvaninii)[2-6]。市場(chǎng)上供應(yīng)的主要有桑樹(shù)桑黃、楊樹(shù)桑黃、暴馬丁香桑黃、樺樹(shù)桑黃、松樹(shù)桑黃等。桑樹(shù)桑黃的多糖、 黃酮和三萜類(lèi)含量均高于其他樹(shù)種，因此桑樹(shù)桑黃為極品，價(jià)格最高[7-9]。隨著人們健康意識(shí)不斷提高，對(duì)高品質(zhì)桑黃產(chǎn)品需求逐漸增大，目前野生桑黃資源匱乏，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足人們對(duì)高品質(zhì)桑黃的需求。因此人工栽培桑樹(shù)桑黃具有廣闊的市場(chǎng)前景，進(jìn)行適宜桑樹(shù)桑黃菌種篩選及人工繁育技術(shù)研究，對(duì)桑樹(shù)桑黃規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化十分重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

桑黃菌株1、2、3、4號(hào)，來(lái)源于金寨尚臻生物科技有限公司。

1.1.2 代料配方原料

桑樹(shù)木屑、玉米粉、稻皮、棉籽殼、熟石膏。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作方法

1.2.1.1 母種培養(yǎng)基

(1)配料：葡萄糖20g、瓊脂20g、鮮馬鈴薯200g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、水1000mL。

(2)制作方法：將鮮馬鈴薯稱(chēng)量水煮攪碎過(guò)濾去渣，再與上述其他配料均勻混合，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、121℃條件下，滅菌20min。

1.2.1.2 原種培養(yǎng)基

(1)配料：主料按桑樹(shù)木屑78%、稻皮20%、石膏粉2%，水分占總質(zhì)量55%。

(2)制作方法：將上述配料混合均勻，裝袋后扎好口，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、123℃條件下，滅菌50min。

1.2.1.3 栽培種培養(yǎng)基

(1)配料：主料按桑樹(shù)木屑78%、稻皮20%、石膏粉2%，水分占總質(zhì)量55%，pH值控制在6～7。

(2)制作方法：將上述配料混合均勻，裝袋后扎好口，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、121℃條件下，滅菌50min。

1.2.2 菌種培養(yǎng)方法

1.2.2.1 母種培養(yǎng)

將桑黃菌株1、2、3、4號(hào)分別接種到母種培養(yǎng)基斜面中，在溫度25℃、濕度65%條件下，避光培養(yǎng)7～10d，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)斜面培養(yǎng)基。

1.2.2.2 原種培養(yǎng)

將上述母種分別接入含有原種培養(yǎng)基的菌袋中，放入人工氣候箱中，在溫度25℃、濕度65%條件下，避光培養(yǎng)，隔天觀察，記錄菌絲粗細(xì)及顏色變化情況，菌袋長(zhǎng)滿(mǎn)的時(shí)間。

1.2.3 適宜桑樹(shù)桑黃菌株的篩選鑒定

1.2.3.1 適宜桑樹(shù)桑黃菌株篩選

桑黃菌株1、2、3、4號(hào)的母種分別接入含有原種培養(yǎng)基的菌袋中，在相同條件下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋，觀察菌絲顏色變化、粗細(xì)、生長(zhǎng)速度，篩選適宜菌株。

1.2.3.2 適宜桑樹(shù)桑黃菌株鑒定

(1)形態(tài)鑒定

將適宜桑樹(shù)桑黃菌株接種到含有母種培養(yǎng)基的平皿，在溫度25℃，濕度65%條件下，避光培養(yǎng)7d左右，觀察菌落形態(tài)。

(2)rDNA ITS分子鑒定[10]

將適宜桑樹(shù)桑黃菌株抽提DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA抽提結(jié)果。設(shè)計(jì)ITS序列引物，將抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。獲得的序列經(jīng)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定分離菌種的分類(lèi)地位。

(3)DNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將測(cè)序獲得的ITS序列通過(guò)BLAST比對(duì)，根據(jù)同源性相似度差異，利用Clustal X(Version 1.83)軟件進(jìn)行多序列匹配排列，用軟件MAFFT version 7，鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)桑黃菌株3號(hào)與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析。

1.2.4 桑黃代料制作

1.2.4.1 桑黃代料配方的篩選

為優(yōu)化桑黃代料配方，本試驗(yàn)通過(guò)參考其他相關(guān)研究及預(yù)試驗(yàn)情況，設(shè)計(jì)桑樹(shù)木屑、玉米粉、稻皮、棉籽殼、熟石膏比例范圍分別為：桑樹(shù)木屑40%～85%，玉米粉2%～20%，稻皮2%～25%，棉籽殼10%～17%，熟石膏1%～3%(見(jiàn)表1)。在此范圍內(nèi)設(shè)置20組配方，按相同培養(yǎng)條件，觀察分析適宜代料配方。

1.2.4.2 桑黃代料的制備

將篩選物料按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的比例混合，加入55%水，裝袋后扎好口，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、123℃條件下，滅菌50min冷卻，將篩選出的適宜桑樹(shù)桑黃菌種接入代料，放入人工氣候箱培養(yǎng)，溫度保持28℃，濕度保持60%～75%，桑黃菌絲一般60d左右長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋。

表1 實(shí)驗(yàn)因素和水平表

1.2.5 桑黃子實(shí)體培養(yǎng)

菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)栽培袋后，等黃色變棕色時(shí)，在顏色最深處割口出黃，出黃溫度30℃～33℃，85%～95%濕度，300lx光照條件下培養(yǎng)30～60d，見(jiàn)子實(shí)體生長(zhǎng)圈顏色變深開(kāi)始干燥不再生長(zhǎng)時(shí)采收。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

桑黃菌株1、2、3、4號(hào)的母種分別接入含有原種培養(yǎng)基的菌袋中，在相同條件下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋，均未出現(xiàn)污染。桑黃菌株1號(hào)培養(yǎng)71d菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋，顏色淺黃，菌絲較粗；2號(hào)培養(yǎng)63d菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋，顏色深黃，菌絲較細(xì)；3號(hào)培養(yǎng)50d菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋，顏色深黃，菌絲較粗；4號(hào)培養(yǎng)67d菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋，顏色淺黃，菌絲較粗。試驗(yàn)結(jié)果表明桑黃菌株3號(hào)比其他3種生長(zhǎng)速率快、菌絲較粗，更適合用桑樹(shù)木屑培養(yǎng)。如表2所示。

表2 四株桑黃菌菌絲生長(zhǎng)情況

圖1 瓦寧纖孔菌菌落形態(tài)

2.2 菌株鑒定

如圖1所示，桑黃菌株3號(hào)在PDA平板上形成的菌落為圓形，氣生菌絲絨毛狀，星狀放射生長(zhǎng)；菌絲初期為白色，后逐漸變?yōu)榈S色、黃色至深褐色。經(jīng)ITS區(qū)測(cè)序，BLAST比對(duì)，綜合鑒定結(jié)果為瓦寧纖孔菌(Inonotusvaninii)。

2.3 分子系統(tǒng)學(xué)分析

根據(jù)桑黃菌株3號(hào)測(cè)定的ITS序列與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的近源菌種結(jié)果，桑黃菌種3號(hào)的ITS序列與瓦寧纖孔菌、鮑式木層孔菌相似度均為100%，結(jié)合Genebank上的8個(gè)桑黃菌種有關(guān)序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建．分枝統(tǒng)計(jì)支持率評(píng)估采用Bootstrap法，自展值為1000。由圖1可知，所有序列形成兩個(gè)大的分支，分別是纖層孔菌和針層孔菌，而桑黃菌種3號(hào)與瓦寧纖孔菌遺傳距離(親緣關(guān)系)最近，見(jiàn)圖2。

圖2 桑黃菌種3號(hào)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 優(yōu)選代料配方分析

如表3所示，本試驗(yàn)對(duì)20組代料配方進(jìn)行比較試驗(yàn)研究。20組均成活，其中平均產(chǎn)量最高、菌絲生長(zhǎng)速率最快是第4組，而桑枝木屑含量最高的14組平均產(chǎn)量卻并不是最高，說(shuō)明桑枝木屑并不是越高越好；第4組玉米粉含量較高，木腐菌瓦寧纖孔菌，不僅以桑枝木屑、稻皮、棉籽殼的纖維素和木質(zhì)素作為碳源，還可利用玉米粉中的糖類(lèi)物質(zhì)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，玉米粉為瓦寧纖孔菌提供了豐富的維生素、磷、鈣和鐵，有利于桑黃的生長(zhǎng)繁育。

表3 優(yōu)化代料配方試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)在桑黃菌株和代料培養(yǎng)配方方面進(jìn)行了研究。從現(xiàn)有的四種桑黃菌株中，篩選出了以桑枝木屑作為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的適宜菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定為瓦寧纖孔菌。大多數(shù)文獻(xiàn)集中報(bào)道了瓦寧纖孔菌以楊樹(shù)作為寄主，而以桑樹(shù)作為寄主鮮有報(bào)道。設(shè)計(jì)了20組配方，按照配方比例進(jìn)行試驗(yàn)，從中篩選出了最佳配比，即桑樹(shù)木屑80%、玉米粉10%、稻皮2%、棉籽殼7%、熟石膏1%。同時(shí)試驗(yàn)表明瓦寧纖孔菌可將玉米粉作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，推測(cè)玉米中的維生素、磷、鈣和鐵可能促進(jìn)該菌的生長(zhǎng)繁育，后續(xù)試驗(yàn)可做深入研究，以期進(jìn)一步提高桑樹(shù)桑黃的產(chǎn)量，為桑樹(shù)桑黃的人工繁育和規(guī)?；耘嗵峁┮欢▍⒖肌?/p>