高 帥, 陳 輝, 胡雪艷, 張紫娟, 范春林*, 王明林

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 泰安 271018; 2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176)

調(diào)味茶是以紅茶為主要原料,加入天然的水果香料制作而成的香薰茶,也稱風(fēng)味茶,最為著名的當屬伯爵茶,其作為一種具有獨特風(fēng)味的飲料而廣受歡迎。茶葉在種植過程中通常會施用多種農(nóng)藥,導(dǎo)致茶葉中殘留農(nóng)藥種類相對較多。為此,許多國家和國際組織針對茶葉制定了嚴格的農(nóng)藥最大殘留限量(MRL),例如,歐盟[1]制定了茶葉中470多種農(nóng)藥的MRLs;日本[2]肯定列表對茶葉制定的農(nóng)業(yè)化學(xué)品限量項數(shù)為270余項,并且在限量標準中未被列出的農(nóng)藥全部采用“一律標準”,即最大殘留限量為0.01 mg/kg。因此,為了確保茶葉質(zhì)量安全,打破進出口貿(mào)易壁壘,需嚴格控制茶葉中的農(nóng)藥殘留水平。

針對上述問題,科研人員建立了多種茶葉中農(nóng)藥殘留的分析方法。常見的茶葉中農(nóng)藥殘留前處理方法主要有超臨界流體萃取法[3]、固相萃取法[4,5]、加速溶劑萃取法[6]、凝膠滲透色譜法[7]、固相微萃取技術(shù)[8]和QuEChERS法[9-11]等,尤其QuEChERS方法應(yīng)用相對較廣。

茶葉中農(nóng)藥殘留的常用檢測方法包括氣相色譜(GC)法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[13]、液相色譜(HPLC)法[14]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[16]及高分辨質(zhì)譜法[17]等。GC和HPLC靈敏度較低,不適于多種農(nóng)藥殘留痕量分析的要求。GC-MS和LC-MS在定性準確度方面尚有欠缺,檢測的農(nóng)藥種類也受到一定限制。液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(LC-Q-TOF-MS)具有高質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)庫檢索等優(yōu)勢,適用于多農(nóng)藥殘留的篩查和確證[18]。當前,國內(nèi)外關(guān)于調(diào)味茶中多農(nóng)藥殘留檢測的研究尚未見報道。

在調(diào)味茶生產(chǎn)過程中加入的各種香精、香料使得本身就比較復(fù)雜的茶葉樣品變得更加復(fù)雜,導(dǎo)致在檢測過程中干擾物對待測農(nóng)藥的影響較大,大大增加了檢測難度。本文對調(diào)味茶中3類農(nóng)藥(殺蟲劑類、殺菌劑類和除草劑類)共計52種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法進行了研究,對提取劑種類和吸附劑(PSA(N-propyl ethylenediamine)、C18和GCB(graphitized carbon black))用量進行了優(yōu)化,同時考察了應(yīng)用LC-Q-TOF-MS進行篩查時的不同檢索參數(shù),建立了QuEChERS凈化結(jié)合LC-Q-TOF-MS篩查調(diào)味茶中52種農(nóng)藥殘留的檢測方法,并對該方法的篩查限(SDL)、定量限、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和回收率進行了驗證。該方法簡單快速,靈敏度高,可以應(yīng)用于各種調(diào)味茶中農(nóng)藥多殘留的篩查與確證。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

Agilent 1290-6550液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司),配有Dual AJS的ESI源;N-EVAP 112氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates公司), TRIO TM-1N渦旋攪拌器(日本AS ONE公司), SR-2DS水平振蕩器(日本TATEC公司), KDC-40低速離心機(中國中佳公司), Milli-Q超純水機(美國Millipore公司), PL602-L電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司),超聲波清洗器(中國江蘇昆山超聲儀器有限公司)。

52種農(nóng)藥標準品:純度≥95%(德國Dr. Ehrenstorfer公司);乙腈為色譜純(美國Honeywell公司);吸附劑:PSA、GCB和C18吸附劑均購于天津Bonna-Agela公司;甲酸(LC-MS級)、乙酸銨(LC-MS級)購于北京化工廠;實驗用水均為高純水(經(jīng)Milli-Q超純水器純化)。

1.2 溶液配制

標準溶液的配制:稱取10 mg標準品于10 mL棕色容量瓶中,以甲醇定容至刻度;對于部分不溶農(nóng)藥,可以選擇乙腈或丙酮等試劑輔助溶解,得到單標準儲備溶液?；旌蠘藴嗜芤旱呐渲?移取適量單標準儲備溶液,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

稱取2 g茶葉樣品于80 mL具塞離心管中,加入20 mL乙腈提取劑,渦旋1 min,以250次/min的頻率振蕩5 min,以4 200 r/min的速度離心5 min,將10 mL上清液轉(zhuǎn)移到含150 mg PSA、100 mg C18和40 mg GCB吸附劑的50 mL具塞離心管中,渦旋1 min,再以250次/min的頻率振蕩5 min,以4 000 r/min的速度離心5 min,取5 mL上清液于試管中,氮吹至干,用1 mL乙腈-水(2∶3, v/v)定容,超聲溶解,過0.22 μm有機相濾膜,供LC-Q-TOF-MS測定。

1.4 LC-Q-TOF-MS條件

1.4.1LC條件

色譜柱:ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。流動相:A相為水(含0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸和5 mmol/L乙酸銨), B相為乙腈。梯度洗脫程序:0 min, 1%B; 3.00 min, 30%B; 6.00 min, 40%B; 9.00 min, 40%B; 15.00 min, 60%B; 19.00 min, 90%B; 23.00 min, 90%B; 23.01 min, 1%B,保持4 min。流速:0.4 mL/min。

1.4.2Q-TOF-MS條件

離子源為Dual AJS ESI源;掃描方式:正離子全掃描;全掃描范圍:m/z50～1 700;毛細管電壓:4 000 V;鞘氣溫度:325 ℃;鞘氣流速:11.0 L/min;干燥氣流速:10.0 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;碎裂電壓:140 V。參比溶液中含嘌呤(C5H4N4,其離子精確相對分子質(zhì)量為121.050 873)和HP-0921(C18H18O6N3P3F24,其離子精確相對分子質(zhì)量為922.009 798)。通過全離子掃描模式進行數(shù)據(jù)采集,應(yīng)用Agilent MassHunter軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

本實驗選取的52種農(nóng)藥均有歐盟MRL標準,包括15種殺蟲劑類農(nóng)藥,19種殺菌劑類農(nóng)藥和18種除草劑類農(nóng)藥。基質(zhì)選擇的是以紅茶為主要原料、再加入天然的水果香料而制成的調(diào)味茶。其基質(zhì)復(fù)雜,含有色素、有機酸等多種基質(zhì)干擾成分。

2.1 提取方式的優(yōu)化

為確保待分析物被充分提取出來,在使用QuEChERS方法對茶葉進行前處理時,通常會添加一定量的水進行浸泡[19]。但是,對于部分非極性農(nóng)藥,加水浸泡并不會改善此類農(nóng)藥的提取效果,反而會因為咖啡堿等水溶性雜質(zhì)的浸出而影響后續(xù)凈化效果[17]。因此,本文對比了水化與不水化兩個條件。兩組茶葉樣品添加農(nóng)藥量均為100 μg/kg,一組加入20 mL水,靜置0.5 h;另一組不加水,其余前處理條件均相同。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):加水的一組52種添加農(nóng)藥回收率在70%～120%的農(nóng)藥數(shù)量為33種;不加水的一組52種添加農(nóng)藥回收率在70%～120%的農(nóng)藥數(shù)量為47種。從提取液的顏色上來看,不加水的組分上清液顏色相對透明,色素干擾小。因此,本文在進行前處理前不對調(diào)味茶葉樣品加水浸泡。

2.2 提取劑的優(yōu)化

對提取劑種類進行了考察,在添加農(nóng)藥量為100 μg/kg的條件下,分別比較了乙腈、1%酸化乙腈、2%酸化乙腈溶液的提取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用純乙腈提取時,提取效果最好。分別使用3種提取液時,52種添加農(nóng)藥回收率在70%～120%的檢出農(nóng)藥數(shù)量為49、44和45種。在采用乙腈提取茶葉中農(nóng)藥時,上清液顏色更清澈,說明其中色素等共提物較少,干擾小。并且當加入氯化鈉時,通過鹽析作用,又有助于乙腈與水分離。故本實驗選擇乙腈為提取液。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS方法的核心是尋求能夠吸附雜質(zhì)的吸附劑。茶葉中含有大量的色素、生物堿、甾醇和茶多酚類等干擾物質(zhì)。針對這些共提物雜質(zhì),一般采用PSA、GCB和C18作為吸附劑進行凈化。其中PSA可有效吸附有機酸和部分糖,C18可有效去除脂肪,GCB可有效去除色素。本試驗在添加農(nóng)藥量為100 μg/kg的條件下,對50、100、150和200 mg PSA的用量進行了考察,結(jié)果如圖1所示。當PSA用量為150 mg時,52種添加農(nóng)藥的回收率在70%～120%之間檢出的數(shù)量最多,為50種。故選擇PSA用量為150 mg。

圖 1 PSA用量對農(nóng)藥檢出數(shù)量的影響Fig. 1 Effects of PSA dosage on the quantity of pesticides detected R: recovery; PSA: N-propyl ethylenediamine.

在添加農(nóng)藥量為100 μg/kg的條件下,對50、100、150和200 mg用量的C18進行了考察,結(jié)果如圖2所示,當C18用量為100 mg時,52種添加農(nóng)藥的回收率在70%～120%之間檢出的數(shù)量最多,為51種,故選擇C18用量為100 mg。

圖 2 C18用量對農(nóng)藥檢出數(shù)量的影響Fig. 2 Effects of C18 dosage on the quantity of pesticides detected

GCB在吸附色素的同時也會吸附平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥,造成某些農(nóng)藥回收率偏低。因此,本文在添加農(nóng)藥量為100 μg/kg的條件下對30、40和50 mg GCB的用量進行了考察。從圖3可以看出,當GCB用量為40 mg時,52種添加農(nóng)藥的回收率在70%～120%之間檢出的數(shù)量最多,為44種。故選擇GCB用量為40 mg。

圖 3 GCB用量對農(nóng)藥檢出數(shù)量的影響Fig. 3 Effects of GCB dosage on the quantity of pesticides detected GCB: graphitized carbon black.

2.4 篩查參數(shù)的優(yōu)化

本方法采用農(nóng)藥化合物列表對農(nóng)藥殘留進行篩查,篩查方法涉及的檢索參數(shù)包括保留時間偏差、精確質(zhì)量數(shù)偏差、共流出得分、峰高閾值和得分等,其中前兩者是篩查方法中較為重要的參數(shù)。因此,本文通過對前兩者進行優(yōu)化,從而最大限度地準確篩查和確證目標農(nóng)藥。通過在調(diào)味茶中分別添加兩組量為10和50 μg/kg的52種農(nóng)藥,對質(zhì)量偏差及保留時間偏差進行優(yōu)化。

圖 4 質(zhì)量偏差對農(nóng)藥檢出數(shù)量的影響Fig. 4 Effects of quality deviation on the quantity of pesticide detected

精確質(zhì)量偏差為實際測定值與理論值之間的差異,是化合物定性的重要依據(jù)。本試驗在±5、±10、±15和±20 ppm(10-6,下同)條件下,對加合離子質(zhì)量偏差進行比對。如圖4所示,當質(zhì)量偏差為5 ppm時,添加農(nóng)藥中未被檢出農(nóng)藥的數(shù)量多于其余組分,涉及的農(nóng)藥有乙嘧酚磺酸酯、仲丁靈等;當質(zhì)量偏差大于10 ppm時,添加農(nóng)藥的檢出數(shù)量并無明顯數(shù)量上的差異,考慮到實際樣品檢測時,增大質(zhì)量偏差會導(dǎo)致假陽性農(nóng)藥出現(xiàn),故本文將質(zhì)量偏差設(shè)置為±10 ppm。

保留時間是化合物在色譜條件下的特征參數(shù),是對農(nóng)藥進行篩查的定性依據(jù)之一。對于LC-TOF-MS方法而言,穩(wěn)定的保留時間可作為輔助定性的重要依據(jù)。因此,本試驗對保留時間的限定范圍進行了探討,對比不同的保留時間窗口(±0.1、±0.3、±0.4、±0.5和±0.8 min),檢出添加農(nóng)藥數(shù)量如圖5所示,當保留時間偏差設(shè)置范圍低于0.3 min時,導(dǎo)致較多添加農(nóng)藥無法被檢出,如乙草胺、綠麥隆等;當保留時間偏差高于0.3 min時,添加農(nóng)藥檢出數(shù)量無明顯差異。但在實際樣品檢測中,放寬保留時間會導(dǎo)致假陽性農(nóng)藥出現(xiàn),故保留時間窗口設(shè)置為±0.3 min。

圖 5 保留時間窗口對檢出農(nóng)藥數(shù)量的影響Fig. 5 Effects of retention time window on the quantity of pesticide detected

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中目標化合物離子化時受到共提物影響,使其電離受到基質(zhì)的干擾,導(dǎo)致離子抑制或增強,會使得基質(zhì)匹配標準溶液的響應(yīng)值比純?nèi)軇┑牡突蛘吒?且這種差異存在于各待測物之間,說明不同農(nóng)藥受到基質(zhì)的影響不同。當基質(zhì)效應(yīng)影響過大時,會降低方法的靈敏度,影響方法的準確性,因此需要對基質(zhì)效應(yīng)進行評價[20],并根據(jù)評價結(jié)果選擇適合的方法對基質(zhì)效應(yīng)進行抵消。本文通過測定一系列不同質(zhì)量濃度溶劑標準溶液(1、2、5、10、20、50、100和200 μg/L)和基質(zhì)標準溶液(2、4、10、20、40、100、200和400 μg/kg),分別建立標準曲線,比較兩條標準曲線的差異,從而判斷基質(zhì)效應(yīng)的強弱。計算公式如下:基質(zhì)效應(yīng)=[(基質(zhì)匹配標準曲線斜率/溶劑標準曲線的斜率)-1]×100%[21]。結(jié)果表明,調(diào)味茶基質(zhì)中52種添加農(nóng)藥里2種農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)、48種農(nóng)藥表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)、2種農(nóng)藥表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1線性范圍、篩查限和定量限

以調(diào)味茶空白樣品制備系列基質(zhì)匹配標準溶液并測定其線性范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn),52種添加農(nóng)藥中,30種的線性范圍為1～200 μg/L、6種的線性范圍為2～200 μg/L、13種的線性范圍為5～200 μg/L、3種的線性范圍為10～200 μg/L,所有添加農(nóng)藥的線性相關(guān)系數(shù)r均不小于0.99,本方法線性良好。參照歐盟SANTE/11813/2017[22]標準要求,52種添加農(nóng)藥的篩查限范圍為0.001～0.01 mg/kg,定量限范圍為0.002～0.02 mg/kg,均低于對應(yīng)農(nóng)藥在MRL歐盟標準中的限量標準。調(diào)味茶中農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、篩查限和定量限見表1。

表 1 調(diào)味茶中農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、篩查限和定量限Table 1 Linear ranges, r, screening detection limits (SDL), and LOQs of the pesticides in flavored tea

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2.6.2回收率和精密度

根據(jù)歐盟農(nóng)藥殘留檢測準則要求,平均回收率需在70%～120%之間,重復(fù)性需低于20%。在10、20、50和100 μg/kg 4個添加水平下,對調(diào)味茶進行重復(fù)性(n=3)添加回收率試驗,52種農(nóng)藥在調(diào)味茶中4個添加水平的回收率范圍均在70%～120%之間,RSD均<20%。調(diào)味茶4個添加水平的農(nóng)藥添加回收率以及精密度數(shù)據(jù)見表2。

表 2 調(diào)味茶4個添加水平的回收率以及精密度(n=3)Table 2 Recoveries and RSDs at four spiked levels in flavored tea (n=3)

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.6.3實際樣品測定

采用本方法對20份市售調(diào)味茶樣品進行了52種農(nóng)藥殘留檢測,其中1份檢出敵草隆(diuron),含量為5.1 μg/kg; 1份檢出噻螨酮(hexythiazox),含量為48.5 μg/kg; 1份檢出三環(huán)唑(tricyclazole),含量為1.1 μg/kg。研究結(jié)果表明,本方法可用于調(diào)味茶葉中52種農(nóng)藥殘留的檢測。

3 結(jié)論

本實驗采用改進的QuEChERS方法對果蔬樣品進行前處理,應(yīng)用LC-Q-TOF-MS進行測定,建立了調(diào)味茶中52種農(nóng)藥殘留的篩查和確證方法。方法的靈敏度、準確度、精密度和線性關(guān)系良好,能滿足歐盟對于茶葉中多農(nóng)藥殘留分析的要求。