周秀錦, 楊會(huì)成, 張 靜, 邵宏宏, 冷向陽, 韓 超

(1. 舟山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心, 浙江 舟山 316000; 2. 浙江海洋開發(fā)研究院, 浙江 舟山 316000; 3. SCIEX公司, 上海 200335; 4. 浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院, 浙江 杭州 310015)

硒作為機(jī)體必需微量元素[1],通過硒蛋白、硒依賴酶的輔助因子等形式,在機(jī)體生長(zhǎng)和維持機(jī)體健康方面起著重要的作用[2-5]。目前研究較多的是生物毒性相對(duì)較小和易于被吸收利用的有機(jī)硒,如硒化氨基多糖。硒化氨基多糖是通過化學(xué)修飾方法將多糖與無機(jī)硒結(jié)合獲得[6],硒和多糖的生理活性和藥理功能得到優(yōu)化,生物活性普遍高于多糖和硒,更易于為機(jī)體吸收和利用[7]。硒化氨基多糖可以作為增強(qiáng)適應(yīng)性免疫性能的潛力含硒膳食補(bǔ)充劑[8]。

黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)是我國(guó)東南沿海地區(qū)及太平洋西岸海水養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類[9]。目前關(guān)于黑鯛對(duì)硒的利用已有初步研究[10],但關(guān)于硒化氨基多糖對(duì)黑鯛免疫調(diào)節(jié)作用的研究較少。代謝組學(xué)能夠?qū)⒃嫉姆从硺悠沸畔⒌膹?fù)雜數(shù)據(jù)(比如飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)和核磁共振掃描數(shù)據(jù)等)經(jīng)過一系列降維處理,直接反映體內(nèi)生物化學(xué)過程和狀態(tài)的變化,在系統(tǒng)研究生物內(nèi)源性小分子代謝物整體和動(dòng)態(tài)改變規(guī)律上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[11-14]。本研究利用高通量、高靈敏度、高分辨質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)和非靶向代謝組學(xué)方法,闡釋硒化氨基多糖對(duì)黑鯛免疫調(diào)節(jié)潛在的機(jī)制和靶標(biāo)途徑,為黑鯛免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB SCIEX ExionLC AD & TripleTOFTM5600+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX公司); XS105分析天平(瑞士Mettler Toledo公司); ST-16R型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);氮吹儀(美國(guó)Organomation公司);乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司), 60 mg/L MS-222(3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate,色譜純,美國(guó)Sigma-Aldrich公司);低聚氨基多糖(low molecular aminopolysaccharide, LA)相對(duì)分子質(zhì)量約為50 kDa,硒化氨基多糖為自制,硒化低聚氨基多糖的硒含量為27.3 mg/g。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣品處理

黑鯛幼魚由浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)提供,停飼1天,挑選體質(zhì)健康、大小均勻、初始體重為(13.00±0.20) g的黑鯛幼魚隨機(jī)分為2組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)25尾魚,放入容積為310 L(水體260 L)的玻璃纖維缸內(nèi)微流水式飼養(yǎng)。飼喂普通飼料中添加0.6 mg Se/kg硒化氨基多糖的魚為實(shí)驗(yàn)組,飼喂不添加硒化多糖普通飼料的魚為空白組,實(shí)驗(yàn)周期為8周,結(jié)束后將試驗(yàn)魚饑餓24 h,用60 mg/L MS-222麻醉,取出肝臟組織,實(shí)驗(yàn)組和空白組各隨機(jī)抽取10個(gè)平行樣,稱重后用液氮快速冷凍,然后放于-80 ℃的超低溫冰箱中保存,備用。

1.3 樣品前處理

取適當(dāng)分量的樣品于15 mL離心管中,加入10倍體積的冰冷甲醇(-20 ℃冷凍)進(jìn)行勻漿,于4 ℃以13 000 r/min的速度離心15 min,取5.0 mL上清液,于40 ℃用氮?dú)獯蹈?用1.0 mL的甲醇-水(4∶1, v/v)復(fù)溶,待測(cè)。

在本試驗(yàn)中,使用質(zhì)控樣品(quality control, QC)進(jìn)行方法驗(yàn)證,各取上述樣品的上清液0.5 mL,混合均勻,于40 ℃用氮?dú)獯蹈?用1.0 mL的甲醇水(4∶1, v/v)復(fù)溶得到。在樣品的檢測(cè)過程中,每隔4個(gè)樣品插入一個(gè)QC樣品,以監(jiān)控檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.4 UPLC-Q-TOF-MS分析條件

1.4.1側(cè)重分析極性小的小分子代謝物的色譜條件

液相色譜:ExionLC AD;色譜柱:Waters HSS T3柱(150 mm×2.1 mm, 2.5 μm),為C18色譜柱;柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣盤溫度:4 ℃;進(jìn)樣量:2 μL。流動(dòng)相A相:水(含2 mmol/L甲酸銨+0.05%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸);B相:乙腈-異丙醇溶液(1∶1, v/v)。A相比例在1.0～5.0 min內(nèi)由95%逐步降至30%, 5.0～14.0 min逐步降至10%, 14.0～16.0 min逐步降至0,保持4 min, 20.1 min時(shí)A相變?yōu)?5%,維持5 min。

1.4.2側(cè)重分析極性大的小分子代謝物的色譜條件

液相色譜:ExionLC AD;色譜柱:Acquity UPLC BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),為HILIC(hydrophilic interaction liquid chromatography)色譜柱;柱溫:45 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣盤溫度:4 ℃;進(jìn)樣量:1 μL。流動(dòng)相A相:水(含10 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸); B相:乙腈-水溶液(95∶5, v/v;含10 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸)。2.0～11.0 min內(nèi),A相比例由0逐漸升至55%,保持1 min, 12.1 min時(shí)A相降至0,維持5 min。

1.4.3質(zhì)譜條件

采用AB SCIEX TripleTOFTM5600+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。采用電噴霧離子(ESI)源正、負(fù)離子掃描模式。噴霧電壓(IS):正離子5 500 V,負(fù)離子-4 500 V;離子化溫度:550 ℃;霧化氣壓強(qiáng):4.14×105Pa;輔助加熱氣壓強(qiáng):4.14×105Pa;氣簾氣壓強(qiáng):2.41×105Pa。一級(jí)質(zhì)譜采集范圍:m/z100～1 250,累積時(shí)間:0.10 s;去簇電壓(DP): 80 V。采用數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)采集(IDA)模式采集二級(jí)質(zhì)譜,采集范圍:m/z50～1 250;累積時(shí)間:0.050 00 s; DP: 80 V;碰撞電壓:(40±20) eV。IDA轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)為:信號(hào)強(qiáng)度>100 cps,相對(duì)分子質(zhì)量誤差為50 mDa,每個(gè)循環(huán)最多監(jiān)測(cè)10個(gè)離子,在4 Da內(nèi)排除同位素。采用Analyst TF 1.7.1軟件控制液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng),并采集分析數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用XCMSplus[15]對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的非靶向代謝組學(xué)分析,采用Centwave特征檢測(cè)算法(峰值寬度從5到20 s,質(zhì)量允差為5 ppm(10-6,下同))進(jìn)行峰的發(fā)現(xiàn)和匹配,找到有差異的化合物,XCMSPlus軟件會(huì)自動(dòng)鏈接到METLIN數(shù)據(jù)譜庫(超過24萬個(gè)代謝物信息,其中12 127個(gè)代謝物有高分辨二級(jí)圖譜),并結(jié)合SCIEX公司獨(dú)有的內(nèi)源性代謝物二級(jí)譜庫(包含550多個(gè)常見的內(nèi)源性代謝化合物,包括分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、CAS編號(hào)、化學(xué)名、結(jié)構(gòu)圖),根據(jù)與譜庫中化合物的精確一級(jí)m/z、同位素豐度比和二級(jí)質(zhì)譜信息,鑒定得出差異物,并把這些差異物通過聚類分析,找出差異通路。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

在快速分析實(shí)驗(yàn)中,采用超高效液相分析系統(tǒng)可以獲得較高的重現(xiàn)性和分離效果,在處理肝臟等復(fù)雜基質(zhì)時(shí),使用不同的色譜技術(shù)是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)特征最大化的關(guān)鍵問題。用于代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)的液相色譜條件,包括所采用的溶劑和洗脫梯度并不是為了加強(qiáng)或針對(duì)任何特定代謝物的分離,而應(yīng)該具有廣適性。本文采用了甲酸銨和甲酸為流動(dòng)相的溶劑,兩種不同的色譜柱對(duì)肝臟樣品進(jìn)行了分析:C18色譜柱更好地分離了極性小的小分子代謝物,HILIC色譜柱對(duì)極性大的小分子代謝物分離效果最好,并結(jié)合Q-TOF-MS/MS技術(shù)分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)肝臟樣本進(jìn)行分離和數(shù)據(jù)采集,實(shí)現(xiàn)了盡可能多地檢測(cè)到小分子代謝物,提高非靶向分析的準(zhǔn)確性和正確性。飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)溫度波動(dòng)很敏感,需要定期校準(zhǔn)保障代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。代謝物是根據(jù)測(cè)量的質(zhì)量數(shù)來確定,因此,準(zhǔn)確的質(zhì)量測(cè)量對(duì)于代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)使用的TripleTOFTM5600+系統(tǒng)采用外部校準(zhǔn)方法,測(cè)量的質(zhì)量誤差控制在5 ppm以內(nèi),確保了采集數(shù)據(jù)過程中獲得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確有效。在IDA模式下,在觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜(TOF-MS/MS)事件時(shí),需要監(jiān)控TOF-MS/MS的最大數(shù),這會(huì)影響數(shù)據(jù)采集的信息量。雖然希望通過最大限度地增加TOF-MS/MS事件數(shù)來提高子離子的采集量,但也要確保色譜峰有足夠的采集數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)。本試驗(yàn)采用的IDA方法為:掃描時(shí)間0.15 s和10個(gè)MS/MS事件,每個(gè)事件的子離子累積時(shí)間為0.05 s,循環(huán)時(shí)間為0.7 s,可以實(shí)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都具有10～12個(gè)采集數(shù)據(jù)點(diǎn),為質(zhì)譜的統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)和同時(shí)進(jìn)行代謝物鑒定提供了高質(zhì)量的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖1為各組樣品典型的總離子流色譜圖(total ion chromatograms, TIC)。由圖1可知,空白組和添加硒化氨基多糖組的圖譜存在一定的差異。在對(duì)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理前,首先對(duì)所獲得的分析數(shù)據(jù)質(zhì)量和有效性進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)有效性驗(yàn)證結(jié)果表明,QC樣品中分布于不同保留時(shí)間的代表性離子色譜峰強(qiáng)度的RSD<5%,保留時(shí)間(RT)的漂移<0.1 min,m/z波動(dòng)范圍不超過5 ppm。不同采集模式下QC樣品的TIC圖(n=8)見圖2。

2.2 肝臟PCA輪廓分析

對(duì)黑鯛肝臟代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非靶向數(shù)據(jù)處理的目的是揭示最大和最具統(tǒng)計(jì)意義的變化。將飼喂硒化氨基多糖實(shí)驗(yàn)組和空白組的黑鯛肝臟正負(fù)離子代謝組學(xué)數(shù)據(jù)由XCMSplusSW軟件分析質(zhì)譜采集數(shù)據(jù),自動(dòng)給出主成分輪廓分析(PCA)。正負(fù)離子模式下的黑鯛肝臟代謝物輪廓分析的PCA結(jié)果見圖3。從圖中可以看出,添加硒化氨基多糖組與空白組相比,HILIC柱和C18柱正負(fù)離子模式下的黑鯛肝臟代謝產(chǎn)物均發(fā)生了明顯的變化。

2.3 潛在生物標(biāo)志物的鑒定

潛在生物標(biāo)志物的鑒定方法為通過一級(jí)質(zhì)譜信息確定相對(duì)分子質(zhì)量,利用二級(jí)質(zhì)譜信息獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。將用C18色譜柱和HILIC色譜柱在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)的質(zhì)譜結(jié)果檢索Metabolite HR MS2library數(shù)據(jù)庫(SCIEX),共準(zhǔn)確鑒定出32個(gè)有差異的生物標(biāo)志物,與空白組相比,硒化氨基多糖添加組代謝生物標(biāo)志物水平升高的有26種,降低的有6種。具體結(jié)果見表1。

圖 1 不同采集模式下各組樣品的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of each group of samples in different collection modes HILIC: hydrophilic interaction liquid chromatography.

圖 2 不同采集模式下質(zhì)控樣品總離子流色譜圖(n=8)Fig. 2 Total ion chromatograms of quality control (QC) samples in different collection modes (n=8)

圖 3 不同采集模式下肝臟代謝物的PCA得分圖Fig. 3 Principal component analysis (PCA) scores for the hepatic metabolites in different collection modes Dmodx: distance to the model x.

2.4 代謝途徑分析

根據(jù)準(zhǔn)確鑒定出的潛在生物標(biāo)志物,利用MetaboAnalyst3.0網(wǎng)站,選用魚為模型,進(jìn)行相關(guān)的代謝通路分析;分析結(jié)果表明,有顯著性差異的32種潛在生物標(biāo)志物主要指向了7條代謝通路(P<0.05),涵蓋了氨基?；?轉(zhuǎn)運(yùn)脫氧核糖核苷酸(tRNA)生物合成、氨基酸代謝、核苷酸代謝、氮代謝等,具體見表2。

表 1 非靶向代謝組學(xué)分析的差異代謝物Table 1 Compound list obtained from untargeted approach and refining process

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

RT: retention time.

表 2 通過MetPA分析得到的代謝通路Table 2 Metabolic pathways by MetPA analysis

氨基酸是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì),氨基酸與免疫系統(tǒng)的形成、器官發(fā)育以及功能的發(fā)揮有著密切的關(guān)系。經(jīng)代謝通路分析,發(fā)現(xiàn)硒化氨基多糖組與空白組相比,在氨基酸合成或代謝、氨酰-tRNA生物合成、嘌呤代謝、氮代謝上存在比較顯著的差異,潛在生物標(biāo)志物(見表1)結(jié)果表明,共有18個(gè)潛在生物標(biāo)志物與11條氨基酸生物合成或代謝通路相關(guān),其中13個(gè)在給予硒化氨基多糖后濃度水平顯著上調(diào)。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中,與空白組相比,硒化氨基多糖組中精氨酸的含量呈下降趨勢(shì)。精氨酸是魚類的必需氨基酸之一,精氨酸及其代謝產(chǎn)物一氧化氮(NO)、鳥氨酸和瓜氨酸可以通過生長(zhǎng)激素等內(nèi)分泌激素起到增強(qiáng)細(xì)胞吞噬和殺菌、促進(jìn)免疫球蛋白的合成等免疫調(diào)節(jié)作用[16-18]。在機(jī)體中精氨酸主要通過2個(gè)代謝途徑參與免疫調(diào)控[19,20],第一個(gè)代謝途徑是精氨酸酶途徑,即精氨酸轉(zhuǎn)化成鳥氨酸并進(jìn)一步生成多胺,鳥氨酸和多胺在動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用;另一條途徑為精氨酸代謝成NO的途徑,NO不僅對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬效應(yīng)有重要作用,還對(duì)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的連接和激活有影響,有助于提高免疫細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性、吞噬作用和溶菌酶的活力[21,22],本實(shí)驗(yàn)中精氨酸含量的降低可能是由于硒化氨基多糖會(huì)調(diào)節(jié)使得精氨酸更多代謝成NO,從而使機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng),這與石丹[23]的研究結(jié)果一致。

谷氨酰胺[24,25]可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的有絲分裂和分化增殖,增加炎癥因子的產(chǎn)生,增加機(jī)體的免疫功能;纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸能刺激單核細(xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,增強(qiáng)免疫反應(yīng)等。本試驗(yàn)中谷氨酰胺、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等在硒化氨基多糖組的含量均高于空白組,表明給予硒化氨基多糖組的魚中,在氨基酸影響免疫調(diào)節(jié)上具有一定的增強(qiáng)作用。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)飼喂硒化氨基多糖的黑鯛肝臟進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。采用C18和HILLIC兩種色譜柱結(jié)合XCMSplus軟件進(jìn)行分析,共篩選出32個(gè)有差異的生物標(biāo)志物,經(jīng)MetaboAnalyst3.0網(wǎng)站分析,飼喂硒化氨基多糖對(duì)黑鯛的氨基酸合成或代謝、氨酰-tRNA生物合成、嘌呤代謝、氮代謝通路產(chǎn)生了影響,硒化氨基多糖發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用可能與氨基酸代謝具有較為密切的關(guān)系。本研究為深入探討硒化氨基多糖的免疫增強(qiáng)機(jī)制奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。