魏涵天 時(shí) 燕 李 玲 林新春

(浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 浙江 杭州 311300)

竹類植物屬于禾本科竹亞科(Bambusoideae)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)植物。竹子開花會(huì)導(dǎo)致桿葉枯黃，地下莖逐漸變黑，失去萌發(fā)力，最終成片死去，嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益[1]。目前，已有關(guān)于竹類的研究報(bào)道，但竹子開花仍然是植物界的一個(gè)難解之謎[2-3]，因此對竹子開花機(jī)理的研究具有十分重要的意義。

早在1991年，Coen等[4]提出了花發(fā)育ABC模型，認(rèn)為存在著A、B和C三類同源異型基因，共同調(diào)控決定了花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊四輪花器官的發(fā)育[5-8]。此后大量研究者對不同植株進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn)，植物花器官的眾多同源異型基因共同調(diào)控花器官的發(fā)育[9-11]。Angenent等[12]在此基礎(chǔ)上，于1995年增加了參與調(diào)控胚珠的發(fā)育的D類基因，并將該模型發(fā)展為ABCD模型。Pelaz等[13]在2000年認(rèn)為還需要E類基因參與調(diào)控四輪花器官，進(jìn)一步將花發(fā)育模型發(fā)展為ABCDE模型。研究表明，竹子花發(fā)育為ABCDE模型，其中雷竹(Phyllostachysviolascens)的PpMADS1和PpMADS2[14]屬于A類基因，綠竹(Bambusaoldhamii)的BoAP3[15]屬于B類基因，綠竹的BoMADS1[16]屬于C類基因，毛竹(Phyllostachysedulis)的PeMADS1[17]、雷竹的PvMADS5[18]和烏腳綠竹(Bambusaedulis)的BeMADS1[19]屬于E類基因。

竹子C類基因(AGAMOUS，AG)屬于MADS-box基因家族，調(diào)控雄蕊和雌蕊的發(fā)育[20]。目前，關(guān)于C類基因的報(bào)道并不常見，本研究以綠竹組培苗為試驗(yàn)材料，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)獲得了綠竹BoAG-like基因的cDNA全長；在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，對其表達(dá)模式進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步研究竹類花發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠竹的花芽和營養(yǎng)植株根、莖、葉分別來源于浙江農(nóng)林大學(xué)組培室繼代一周后的花芽試管苗和營養(yǎng)試管苗[21]。采用Trizol法提取RNA，并于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 綠竹BoAG-like基因克隆與序列分析

采用3′RACE技術(shù)拼接出BoAG-like序列全長。根據(jù)3′-Full RACE Core set Ver.2.0試劑盒(TaKaRa，日本)引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)了引物GSP1(5′-C A A C A G C G T G A A A G C A A C C A TT-3′)和GSP2(5′-T G A G C C A C A G G G A C T T A A G C A G CT-3′)。經(jīng)1%瓊脂糖檢測后，純化、回收PCR產(chǎn)物，并連接到pMD-20T載體；經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化DH5α，在氨苯青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆，并送至上海生工生物工程服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上BLAST比對后，分別獲取玉米(ZMM1、ZAG2、ZAG1、ZAGL5、ZMMADS4)、二穗短柄草(BdMADS18、BdAGL25、BdMADS3、BdMADS8、BdAGL6)、水稻(OsMADS58、OsMADS8、OsMADS6、OsMADS17)、毛竹(PeMADS3)、擬南芥(AtAGL1/SHP1、AtAGL5/SHP2、AtAG、AtAGL11/STK、AtAGL6)和楊樹(PtAG、PtAGL11、PtAGL19、PtMADS1、PtAGL6)中的AG同源基因。利用DNAMAN軟件對上述基因進(jìn)行序列氨基酸編輯，并用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 綠竹BoAG-like基因的組織特異性表達(dá)分析

以綠竹花芽試管苗不同時(shí)期的花芽和不開花試管苗的根莖葉為材料[22]，分別提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；利用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量分析儀(BIO-RAD，美國)對綠竹的花芽和根莖葉進(jìn)行熒光定量分析。以Actin基因(登錄號(hào)：BAC99043)為內(nèi)參，Actin上游引物為5′-T G A G C T T C C T G A T G G G C A AG-3′，下游引物為3′-C C T G A T A T C C A C G T C G C A C TT-5′。BoAG-like上游引物為5′-G C C G T G G A C G T C T C T A C G AG-3′，下游引物為5′-T A G T G C T G G G C A G T G A T C T C TG-3′。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法[23]計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoAG-like序列分析

通過前期的cDNA文庫篩選工作發(fā)現(xiàn)，其中1條EST序列(Bo012)與AG基因序列相似性較高，可能與AG基因同源，且分析發(fā)現(xiàn)此序列缺少了3′端[21]。通過3′RACE技術(shù)擴(kuò)增得到了該EST序列3′端的400 bp的片段，將3′RACE獲得的序列與EST序列進(jìn)行拼接，得到了1條全長為1 213 bp的cDNA序列，其含有1條完整的ORF序列，長度為792 bp。核苷酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列為AG同源基因，與水稻、玉米、二穗短柄草等植物的AG基因有很高的同源性，故將其命名為BoAG-like。DNAMAN軟件分析顯示，該片段編碼263個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為100.36 kDa，等電點(diǎn)為5.00。Expasy protscale軟件分析該基因蛋白的疏水性，結(jié)果顯示其GRAVY值為-0.813，屬于親水性蛋白。

通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST軟件對比查找出各物種的AG基因及其同源基因，采用DNAMAN對這些基因編碼的蛋白作序列比對。由圖1可知，BoAG-like蛋白屬于MADS-box家族，具有植物MADS-box蛋白典型的特征，其編碼肽鏈包含MADS盒、K區(qū)2個(gè)保守區(qū)和Ⅰ區(qū)、C區(qū)2個(gè)非保守區(qū)，且具有AG基因特有的AG Ⅰ區(qū)和AG Ⅱ區(qū)；BoAG-like蛋白與來自其他單子葉植物的某些MADS-box蛋白高度同源，與水稻OsMADS58、玉米ZAG1、毛竹PhMADS58和二穗短柄草BdMADS18的一致性分別為89.41%、87.36%、89.31%和91.24%，與擬南芥AtAG和楊樹PtAG的一致性分別為62.60%和64.73%。

在上述對比查找出來的蛋白中，挑選了幾條和AG蛋白相似度比較高的序列，利用MEGA7軟件中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2可知，BoAG-like蛋白屬于C類蛋白的eu-AG系，且該蛋白與水稻OsMADS58親緣關(guān)系最近。

2.2 BoAG-like蛋白及其同源蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等[23]。用SOMPA軟件分析BoAG-like基因及其同源基因OsMADS58、BdMADS18、PhMADS3、ZAG1、AtAG、PLE和PtAGL11編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(圖3)。由表1可知，α-螺旋含量最高和最低分別為PhMADS3(60.75%)和AtAG(41.27%)，無規(guī)則卷曲含量最高和最低分別為AtAG(32.14%)和PhMADS3(16.23%)，BoAG-like的α-螺旋含量(55.51%)和無規(guī)則卷曲含量(20.91%)處于中等水平；延伸鏈含量最高和最低分別為OsMADS58(18.40%)和PLE(8.37%)，β-轉(zhuǎn)角含量最高和最低分別為PtAGL11(11.11%)和OsMADS58(6.25%)，BoAG-like的延伸鏈含量(15.59%)和β-轉(zhuǎn)角含量(7.98%)處于中等偏下水平。

蛋白質(zhì)在形成立體三級結(jié)構(gòu)時(shí)，其多肽鏈部分首先折疊形成α-型螺旋和β-型結(jié)構(gòu)，再進(jìn)一步折疊成立體球型從而發(fā)揮其生物學(xué)功能[24]。利用Swiss-model workspace對上述這8個(gè)蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BoAG-like蛋白與OsMADS58蛋白、BdMADS18蛋白相似度最高(圖4)。這三者蛋白都具有相似的同源二聚體(homo-dimer)和同源四聚體(homo-tetramer)，其中OsMADS58蛋白和BdMADS18蛋白空間構(gòu)型更為接近，然而BoAG-like蛋白與OsMADS58和BdMADS18兩個(gè)蛋白在同源二聚體和同源四聚體的空間結(jié)合上又存在明顯的差異。

圖1 BoAG-like與其他物種相關(guān)MADS蛋白序列比較Fig.1 Amino acid sequence comparison of BoAG-like and the related MADS proteins

圖2 基于BoAG-like基因氨基酸序列構(gòu)建的同源基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of homologous genes based on the amino acid sequence of BoAG - like

圖3 BoAG-like蛋白及其同源蛋白的二級結(jié)構(gòu)的分布Fig.3 Predicted secondary structure of BoAG-like protein and its’ homologous proteins

2.3 BoAG-like組織特異性分析

由圖5可知，熒光定量PCR結(jié)果表明BoAG-like在花器官中表達(dá)量最高，在營養(yǎng)器官中的表達(dá)量都較低。其中BoAG-like在根、莖、葉中的表達(dá)量均較低，在花芽中的表達(dá)量最高(圖5-A)；綠竹花發(fā)育過程中，BoAG-like在花芽中的表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢，在花芽生長后期達(dá)到頂峰(圖5-B)；且不同花芽部分中，BoAG-like在雌蕊中的表達(dá)量最高，其次為雄蕊，漿片再次之，內(nèi)稃中表達(dá)量較低，外稃中的表達(dá)量最低，且雌蕊中的表達(dá)量明顯高于其他花芽部位中的表達(dá)量(圖5-C)。表明BoAG-like在綠竹花發(fā)育過程起到了重要的作用。對不同發(fā)育時(shí)期的綠竹花芽進(jìn)行解剖，觀察發(fā)現(xiàn)綠竹花器官由內(nèi)稃和外稃包被，內(nèi)含漿片，由3～4個(gè)雄蕊和1個(gè)雌蕊組成(圖6)。圖7為不同時(shí)期的綠竹大中小花芽。

表1 BoAG-like蛋白及其同源蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件組成Table 1 Composition of predicted secondary structure of BoAG-like and its homologous proteins/%

注：A：綠竹BoAG-like蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖；B：水稻OsMADS58蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖；C：二穗短柄草BdMADS18蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。Note: A: Predicted tertiary structures of BoAG-like of Bambusa oldhamii. B: Predicted tertiary structures of OsMADS58 of Oryza sativa. C: Predicted tertiary structures of BdMADS58 of Brachypodium distachyon.圖4 BoAG-like蛋白及其相似蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.4 Predicted tertiary structures of BoAG-like and its’ similar proteins

注：A: 不同組織； B：花發(fā)育過程； C： 不同花芽部分。Note: A: Different tissues. B: Flower development stages. C: Different flower buds partial.圖5 BoAG-like基因的表達(dá)模式Fig.5 The expression pattern of BoAG-like in Bambusa oldhamii

注：Pa：內(nèi)稃，Le：外稃，Lo:漿片，An：雄蕊，Pi：雌蕊。Note: Pa: Palea. Le: Lemma. Lo: Lodicule. An: Androecium. Pi: Pistil.圖6 綠竹花芽解剖圖Fig.6 The anatomical morphology of flower bud in Bambusa oldhamii

圖7 不同時(shí)期的綠竹花芽Fig.7 Flower buds of Bambusa oldhamii at different developmental stages

3 討論

AG基因家族進(jìn)化過程中產(chǎn)生了euAG和PLE兩個(gè)進(jìn)化系[25]。在擬南芥中C功能基因AtAG屬于euAG類，而在金魚草(Antirrhinummajus)中，C類功能基因AmPLE屬于PLE類[26]。本研究分離的BoAG-like蛋白質(zhì)序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹中屬于C類基因的euAG系，BoAG-like與水稻、二穗短柄草等AG-like同源蛋白所編碼的氨基酸序列同源性達(dá)到80%以上，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚為一類。在花發(fā)育的ABC模型中，C類基因在第3輪器官和B類共同作用形成雄蕊，在第4輪器官單獨(dú)作用形成雌蕊[27-28]。熒光定量PCR結(jié)果表明，BoAG-like隨著花發(fā)育的過程表達(dá)量呈上升趨勢，在花芽中BoAG-like的雌蕊和雄蕊表達(dá)量最高，推斷該基因可能參與了花器官的發(fā)育。

綠竹BoAG-like和水稻OsMADS58及二穗短柄草BdMADS18序列一致性較高，分別為89.41%和91.24%，這三者編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)元件組成也十分相似，預(yù)測得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)均具有相似的同源二聚體和同源四聚體，但OsMADS58蛋白和BdMADS18蛋白的三級結(jié)構(gòu)更為接近，BoAG-like蛋白的三級結(jié)構(gòu)與這兩個(gè)蛋白在同源二聚體和同源四聚體的空間結(jié)合上存在著明顯的差異。此外，綠竹BoAG-like、水稻OsMADS58和二穗短柄草BdMADS18均屬于C類基因，控制著雄蕊和雌蕊的發(fā)育，但綠竹BoAG-like基因在花芽中雌蕊的表達(dá)量遠(yuǎn)高于雄蕊；而水稻OsMADS58在花發(fā)育初期僅在雄蕊中有表達(dá)，在花發(fā)育的中后期OsMADS58逐漸在心皮中有表達(dá)，但在整個(gè)花發(fā)育過程中OsMADS58在雌蕊的相對表達(dá)量均最高[29]；二穗短柄草BdMADS18在雄蕊、心皮、漿片和內(nèi)稃中均有明顯的表達(dá)，在雌蕊中的表達(dá)量最高[30]。綠竹BoAG-like與水稻和二穗短柄草的同源蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)存在差異，其原因可能與該基因特殊的表達(dá)模式有關(guān)，也可能與竹子獨(dú)特的開花生物學(xué)特性有關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆獲得了綠竹BoAG-like，該基因具有AG基因特有的AG Ⅰ和AG Ⅱ區(qū)。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明BoAG-like屬于C類基因的eu-AG系，且該基因編碼的蛋白與水稻OsMADS58和二穗短柄草BdMADS18親緣關(guān)系最近。蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，BoAG-like與OsMADS58和BdMADS18最為相似，但也存在明顯差異。熒光定量PCR結(jié)果表明，BoAG-like基因在花器官的表達(dá)量遠(yuǎn)高于營養(yǎng)器官的表達(dá)量，且隨著綠竹花發(fā)育的進(jìn)程呈上升趨勢；BoAG-like表達(dá)量在綠竹花芽不同部位存在明顯差異，其中在雌蕊中最高，在內(nèi)稃和外稃中的表達(dá)量較低，表明該基因可能參與了竹子花器官的發(fā)育。本研究結(jié)果為闡明竹子花發(fā)育的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。下一步可通過純化蛋白，對BoAG-like蛋白進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)解析，并采用過表達(dá)和基因編輯技術(shù)對BoAG-like基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。