郗澤文,司昀靈,鄒立強,劉 偉
(南昌大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)
醬鹵肉制品在國內(nèi)發(fā)展歷史悠久,因風(fēng)味和口感俱佳而備受消費者的喜愛[1]。然而由于長期以來的生產(chǎn)、銷售和消費習(xí)慣,醬鹵肉均以散裝、鮮食為主,使得人們對醬鹵肉制品的保鮮技術(shù)研究相對滯后[2]。
天然生物防腐劑如乳酸鏈球菌素(Nisin)、納他霉素等因具有安全、高效等特點已成為國內(nèi)外食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點[3]。Nisin是一種天然抗菌多肽,對大多數(shù)革蘭氏陽性菌具有較好的抑菌效果,還具有較好的耐酸性以及在較低pH下的熱穩(wěn)定性[4]。納他霉素是一種酯類抗真菌劑,是被FDA推薦的僅有的兩種生物防腐劑之一,對霉菌、酵母菌有抑制作用,但其無抗細(xì)菌活性[5]。此外,可食用膜在肉制品保鮮領(lǐng)域中有著獨特的優(yōu)勢,可改變表面微氣調(diào)的環(huán)境,有效防止汁液流失和隔絕外界微生物,從而達到防腐保鮮的目的[6]。張曉春等[7]使用殼聚糖對鹵鵝表面進行了涂膜保鮮應(yīng)用。海藻酸鈉具有良好的生物相容性和可降解性,且價格低廉、成膜性好,更重要的是已被國標(biāo)允許添加在醬鹵肉制品中,較適合作為肉制品的可食性膜材料。
由于海藻酸鈉自身不具備抗菌性,故單獨使用涂膜效果較差[8]。Nisin對革蘭氏陽性菌,尤其是芽孢桿菌有很強的抑制作用,但它的抑菌譜較窄,因此可以與納他霉素抑菌譜互補發(fā)揮協(xié)同增效的作用。目前,采用復(fù)配保鮮涂膜液延長鹵鴨脖貨架期的研究鮮有報道,本文以不同濃度的海藻酸鈉、Nisin、納他霉素對鹵鴨脖進行保鮮處理,研究在儲藏過程中鹵鴨脖品質(zhì)的變化,通過單因素實驗選出三種保鮮劑最優(yōu)濃度,然后進行L9(34)正交實驗,進一步篩選得到最佳復(fù)合保鮮涂膜液,以期延長鹵鴨脖的貨架期。
鹵鴨脖產(chǎn)品 江西煌上煌集團有限公司(經(jīng)原料鴨脖、鹽腌、鹵制、攤涼、切割、氣調(diào)包裝等環(huán)節(jié)完成產(chǎn)品的制作過程,包裝盒內(nèi)充N2);Nisin、納他霉素 浙江銀象生物工程有限公司;海藻酸鈉、碘乙酸鈉、氯化鉀、2-硫代巴比妥酸、甲基紅、次甲基藍、氧化鎂等試劑 國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司;平板計數(shù)培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;其它試劑 均為分析純。
PL602-L型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CR-400 色差計 日本柯尼卡-美能達公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;3110恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo Fihser科技公司。
1.2.1 保鮮液的制備 稱取Nisin 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 g,分別溶于100 mL無菌水中,配制成濃度梯度為0~1.2 g/100 mL的Nisin保鮮液;稱取納他霉素0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g,分別溶于100 mL無菌水中,配制成濃度梯度為0~0.30 g/100 mL的納他霉素保鮮液;稱取0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g的海藻酸鈉分別加入100 mL無菌水中,70 ℃水浴加熱3 h至溶液呈均一狀態(tài),冷卻至室溫后加入1.5%的甘油作塑化劑,得到濃度梯度為0~1.5 g/100 mL的海藻酸鈉保鮮液。
1.2.2 保鮮液對鹵鴨脖的保鮮處理 從4 ℃冷庫中取出當(dāng)日生產(chǎn)的氣調(diào)包裝鹵鴨脖,在無菌操作臺中取樣分別浸沒保鮮液10 s,置于篩網(wǎng)瀝水瀝干,轉(zhuǎn)入聚乙烯袋真空包裝。所有樣品于4 ℃儲藏第9 d測定指標(biāo),每次實驗做三次平行。
1.2.3 單因素實驗 采用單因素實驗法,用不同濃度的Nisin、納他霉素、海藻酸鈉對鹵鴨脖進行保鮮處理,真空包裝后置于4 ℃儲藏第9 d取樣分別測定菌落總數(shù)、pH、TVB-N和TBARS值。海藻酸鈉濃度設(shè)置為0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g/100 mL;Nisin 0、0.2、0.5、0.8、1.0、1.2 g/100 mL;納他霉素濃度設(shè)置為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 g/100 mL。
1.2.4 正交優(yōu)化實驗 為了得到最佳的天然復(fù)合保鮮涂膜液,在單因素實驗研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,以L9(34)正交設(shè)計方法優(yōu)化海藻酸鈉、Nisin與納他霉素的最優(yōu)組合水平,樣品貯藏第9 d測定菌落總數(shù)、TBARS值、TVB-N值,作為保鮮效果的衡量指標(biāo)。正交實驗因素水平設(shè)置見表1。通過直觀分析法得到影響測定指標(biāo)的主次順序和最佳配比,并用方差分析其結(jié)果。
表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
1.2.5 驗證實驗 取當(dāng)日生產(chǎn)的氣調(diào)包裝鹵鴨脖,在無菌操作臺中取樣浸沒于最優(yōu)組合的涂膜液10 s,置于篩網(wǎng)瀝水瀝干,轉(zhuǎn)入聚乙烯袋真空包裝,對照組為相同體積的無菌水。在第1、4、8、12、15 d測定肉樣的菌落總數(shù)、pH、TBARS值、TVB-N值與色差值驗證正交實驗,篩選最佳復(fù)合保鮮涂膜液。
1.2.6 樣品測定前處理 于無菌操作臺中對鴨脖使用滅菌器械進行取樣。用手術(shù)鉗插入鴨脖中軸骨空心處以左手固定,右手持鑷子沿紋理方向從鴨脖表面撕下肉樣置于培養(yǎng)皿內(nèi),使用手術(shù)剪將其剪碎,備用待測。
1.2.7 指標(biāo)測定
1.2.7.1 菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物菌落總數(shù)測定中的方法測定。
1.2.7.2 鴨脖pH的測定 準(zhǔn)確稱取5.0 g肉樣,加入50 mL蒸餾水,剪碎后6000 r/min分散30 s后勻漿用pH計在室溫下直接測定。
1.2.7.3 鴨脖脂質(zhì)過氧化(TBARS)的測定 參照Xiong等[9]略作修改。稱取10 g絞碎均勻的肉樣,加入50 mL 7.5%三氯乙酸(含0.1% EDTA),搖蕩30 min,過濾,取5 mL上清液,加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液并沸水浴加熱40 min,取出冷卻后離心(4000 r/min,20 min),取上清液并加入5 mL氯仿,搖勻靜置分層,取上清在 532 nm處比色。計算公式如下:
TBARS(mg/kg)=(A532/Ws)×9.48
式中:A532為待測液在532 nm下的吸光度值;Ws為肉樣品的質(zhì)量(g)。
1.2.7.4 鴨脖揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照GB/T 5009.228-2016自動凱氏定氮法進行測定。
1.2.7.5 鴨脖色差的測定 參照Noori等[10]的測定方法。取各樣品鴨脖,使用色差計對鴨脖表面進行測定。自檢后使用白板進行標(biāo)準(zhǔn)校正,每個樣品隨機測定5點。色度坐標(biāo)L*、a*、b*被記錄用于計算總色差值ΔE*。計算公式為:
實驗中每組數(shù)據(jù)均進行3次重復(fù),使用SPSS 22.0(SPSS Inc.,USA)進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,并對實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)進行分析。當(dāng)p<0.05時,認(rèn)為組間差異顯著。
海藻酸鈉涂膜在第9 d時理化及菌落總數(shù)指標(biāo)的結(jié)果見表2,使用0、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 g/100 mL 海藻酸鈉進行涂膜保鮮結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白組儲藏第9 d時,空白組各項指標(biāo)已腐敗變質(zhì)超標(biāo),而使用了海藻酸鈉可食用膜涂膜的實驗組各項指標(biāo)均顯著優(yōu)于空白組(p<0.05)。海藻酸鈉自身并不具備抗菌性及抗氧化性,從側(cè)面說明海藻酸鈉是通過可食用膜的形式覆蓋在鴨脖表面,使其具備一定的保鮮作用,抑制需氧菌的生長[11]。最優(yōu)的指標(biāo)分別為菌落總數(shù)對數(shù)值(5.14±0.14)lg CFU/g、pH6.10±0.08、TBARS(1.98±0.09) mg/kg、TVB-N(18.28±0.27) mg/100 g,出現(xiàn)在海藻酸鈉濃度為0.8~1.5 g/100 mL的實驗組,表明海藻酸鈉涂膜對鹵鴨脖有抑菌作用及抗氧化效果,其中1.0~1.5 g/100 mL的實驗組之間差異不明顯,表明濃度在1.0 g/100 mL時已基本達到最優(yōu)濃度。且高于1.0 g/100 mL濃度后菌落總數(shù)有所升高。此外,海藻酸鈉作為多糖,也是一種微生物可以利用的碳源,且濃度過高會使得涂膜液變得粘稠。以上結(jié)論表明海藻酸鈉可食用膜具備一定的保鮮作用,且最優(yōu)濃度為1.0 g/100 mL。
表2 不同濃度海藻酸鈉可食用涂膜保鮮的鴨脖第9 d的各項指標(biāo)Table 2 Results for the 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of sodium alginate edible film
由表3可見,在第9 d時,空白組的各項指標(biāo)分別為菌落總數(shù)對數(shù)值(6.06±0.10)lg CFU/g、pH5.47±0.06、TBARS(2.73±0.06) mg/kg、TVB-N(22.26±0.47) mg/100 g,已經(jīng)不能食用??咕鷦㎞isin的抑菌效果非常顯著,由于Nisin對于細(xì)菌的抑制效果與有效濃度呈正相關(guān)[12],因此隨著濃度增大其抑菌效果越顯著(p<0.05),最大濃度Nisin的菌落總數(shù)對數(shù)值僅為(4.14±0.09)lg CFU/g。Nisin對于鴨脖微生物指標(biāo)的影響進一步帶動理化指標(biāo)的變化,在0.8 g/100 mL時的pH逐步上升至(6.11±0.09)。表明鴨脖中的優(yōu)勢菌—乳酸菌被明顯抑制[1],pH較空白組有顯著性差異(p<0.05)。對于TBARS指標(biāo)而言,Nisin濃度為0.8~1.2 g/100 mL時,組間差異不顯著(p>0.05);而對于TVB-N指標(biāo)而言,當(dāng)Nisin濃度大于1.0 g/100 mL時,組間差異不顯著(p>0.05)。結(jié)合測定指標(biāo)與經(jīng)濟效益,得出0.8 g/100 mL的Nisin為最佳濃度。
表3 不同濃度Nisin保鮮的鴨脖第9 d的各項指標(biāo)Table 3 Results of various indexes for 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of nisin
從表4中可以看出,采用0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/100 mL納他霉素實驗發(fā)現(xiàn)第9 d空白組已完全腐敗,而實驗組各項指標(biāo)均優(yōu)于空白組。隨著納他霉素濃度升高,保鮮效果逐漸增強,但較Nisin而言其保鮮效果較弱。在濃度最高為0.30 g/100 mL時的各項指標(biāo)分別為菌落總數(shù)對數(shù)值(5.28±0.03)、pH(5.61±0.08)、TBARS(2.56±0.04) mg/kg、TVB-N(18.86±0.42) mg/100 g。納他霉素適用于表面滅菌,滲透性較差,且對真菌抑菌性顯著高于細(xì)菌,但引起鹵鴨脖腐敗變質(zhì)的主要微生物為細(xì)菌[1]。此外,雖然實驗組各項指標(biāo)顯著高于(或低于)空白組,但當(dāng)濃度高于0.15 g/100 mL時實驗組間差異不顯著(p>0.05),結(jié)合測定指標(biāo)與經(jīng)濟效益,選擇0.15 g/100 mL作為納他霉素的最佳濃度。
表4 不同濃度納他霉素保鮮的鴨脖第9 d的各項指標(biāo)Table 4 Results of various indexes for 9th day of pot-stewed duck’s neck with different concentrations of natamycin
在對海藻酸鈉、Nisin和納他霉素進行單因素實驗的基礎(chǔ)上,使用正交設(shè)計優(yōu)化三因素三水平得到最優(yōu)組合。在儲藏期間,以菌落總數(shù)、TBARS與TVB-N為評價指標(biāo)進行分析。極差分析結(jié)果見表5,極差值(R)反映的是因素對檢測指標(biāo)的影響程度,R值越大表明對保鮮效果的影響越大。TBARS與TVB-N對鹵鴨脖保鮮效果影響的因素順序:海藻酸鈉>Nisin>納他霉素。菌落總數(shù)對數(shù)值對鹵鴨脖保鮮效果影響的主次順序:Nisin>海藻酸鈉>納他霉素。從方差分析結(jié)果(表6)可以得出保鮮涂膜液對鹵鴨脖保鮮效果的顯著水平,以TBARS來觀察,海藻酸鈉影響極顯著(p<0.01),Nisin影響顯著(p<0.05);以TVB-N來觀察,各因素對實驗結(jié)果均有顯著影響(p<0.05),其中海藻酸鈉對TBARS與TVB-N實驗結(jié)果為極顯著影響(p<0.01)。以菌落總數(shù)對數(shù)值來觀察,只有Nisin具有顯著性影響(p<0.05),而納他霉素?zé)o顯著性影響(p>0.05)。根據(jù)表5各測定指標(biāo)的K值確定各因素的最優(yōu)水平組合。菌落總數(shù):A2B3C3;TBARS:A3B3C3;TVB-N:A2B2C3。由于各項指標(biāo)分析得到的最優(yōu)組合均不一致,考慮到國家標(biāo)準(zhǔn)對于醬鹵熟肉制品僅明確了菌落總數(shù)的限制,而對TBARS與TVB-N未作規(guī)定,經(jīng)綜合平衡分析[13],得到最優(yōu)組合為A2B3C3,即海藻酸鈉 1.0 g/100 mL、Nisin 0.9 g/100 mL、納他霉素0.18 g/100 mL。
表5 正交實驗結(jié)果及直觀分析表Table 5 Results and visual analysis for orthogonal experiment
表6 L9(34)正交實驗方差分析表Table 6 Variance analysis of L9(34)orthogonal experiment
2.5.1 最優(yōu)組合對鹵鴨脖冷藏期間菌落總數(shù)的影響 如圖1所示,菌落總數(shù)整體呈上升趨勢,最優(yōu)組合的涂膜液對菌落總數(shù)有較大的抑制作用,最優(yōu)組合顯著低于對照組鴨脖的菌落總數(shù)(p<0.05),在儲藏8 d時對照組的菌落總數(shù)對數(shù)值就已達到(5.69±0.11)lg CFU/g,遠超國家標(biāo)準(zhǔn)4.903 lg CFU/g[13]。而最優(yōu)組合的菌落對數(shù)值僅為(4.49±0.07)lg CFU/g,低于國家標(biāo)準(zhǔn),表明最優(yōu)組合的可食用膜涂膜后的抑菌效果較好。到第12 d,由于微生物的大量繁殖,致使對照組較國家標(biāo)準(zhǔn)超出兩個數(shù)量級,而最優(yōu)組剛達到國家標(biāo)準(zhǔn)上限值,其菌落總數(shù)對數(shù)值為(4.90±0.08)lg CFU/g,這與對照組相比差異顯著(p<0.05)。第15 d時,最優(yōu)組菌落總數(shù)對數(shù)值為(5.37±0.08)lg CFU/g。最優(yōu)組合中的海藻酸鈉形成的可食用膜隔絕了氧氣,抑制了需氧菌的生長。然而,據(jù)報道真空包裝對乳酸菌這一專性厭氧菌的生長有利[14],而Nisin能抑制乳酸桿菌屬在內(nèi)的大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖。此外,菌落總數(shù)與TVB-N的趨勢相一致,可能是因為微生物的生長促進了蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的降解[15]。綜上,最優(yōu)組合可以達到顯著抑菌保鮮的效果。
圖1 最佳復(fù)配組合對鹵鴨脖冷藏期間的菌落總數(shù)對數(shù)值的影響
2.5.2 最優(yōu)組合對鹵鴨脖冷藏期間pH影響 乳酸菌是鹵鴨脖中的優(yōu)勢腐敗菌[1],可以代謝產(chǎn)酸使pH下降,而蛋白質(zhì)經(jīng)微生物分解生成胺類物質(zhì)則使pH上升。鹵鴨脖在冷藏期間pH變化情況如圖2所示,隨著時間的延長,兩組的 pH均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,且對照組均顯著低于最優(yōu)組(p<0.05),原因可能是脂肪酸化和糖原分解產(chǎn)酸,致使對照組鴨脖冷藏初期呈弱酸性[16];從第8 d開始,對照組 pH呈現(xiàn)顯著上升趨勢,可能是由于此階段的微生物快速生長,新陳代謝產(chǎn)生了堿性含氮物質(zhì)如胺和三甲胺等,導(dǎo)致pH急速上升[15]。而最優(yōu)組合pH的拐點也出現(xiàn)在第8 d,之后pH出現(xiàn)了顯著性增加(p<0.05)。從側(cè)面說明,最優(yōu)組合的添加有效抑制了微生物的生長。在第12 d時,對照組的肉樣已經(jīng)完全腐敗,大量繁殖的微生物促使對照組在8~15 d pH顯著增長(p<0.05),而最優(yōu)組在第15 d時的pH為(5.85±0.06)與第4 d時無顯著性差異(p>0.05)。可見,最優(yōu)組合可達到非常顯著的保鮮效果,這一實驗結(jié)果與李婷婷等[17]關(guān)于儲藏期間糖原經(jīng)糖酵解產(chǎn)酸,而后微生物分解蛋白質(zhì)等產(chǎn)生的堿性物質(zhì)使其pH先下降后上升的研究結(jié)論一致。由此,可以看出最優(yōu)組合對鹵鴨脖具有明顯的保鮮效果。
圖2 最佳復(fù)配組合對鹵鴨脖冷藏期間的pH影響
2.5.3 最優(yōu)組合對鹵鴨脖冷藏期間TBARS值影響 從圖3可以看出,在儲藏期間,對照組與最優(yōu)組合的TBARS值變化趨勢均與時間呈正相關(guān),這可能是由于不飽和脂肪酸在氧的作用下發(fā)生了脂質(zhì)氧化,其生成的醛和酮使得TBARS值升高[18]。在儲藏第1 d時,最優(yōu)組合的TBARS值就已顯著低于對照組(p<0.05),兩組的TBARS值均呈顯著上升趨勢(p<0.05),并且對照組均顯著高于最優(yōu)組(p<0.05),表明最優(yōu)組合不僅在最初就表現(xiàn)出了抗氧化作用,在整個儲藏過程中都參與抑制脂質(zhì)的過氧化。第15 d時,最優(yōu)組TBARS值為(2.68±0.08) mg/kg。海藻酸鈉具有良好的成膜性,能夠有效阻隔氧氣接觸樣品,且復(fù)合涂膜液中的Nisin與納他霉素對微生物的抑菌作用進一步抑制了脂質(zhì)氧化??梢?復(fù)合保鮮涂膜液可達到較好的保鮮效果。
圖3 最佳復(fù)配組合對鹵鴨脖冷藏期間的TBARS值影響
2.5.4 最優(yōu)組合對鹵鴨脖冷藏期間TVB-N值的影響 由圖4可知,隨著時間的延長,兩組的TVB-N值均呈現(xiàn)上升的趨勢,并且對照組均顯著高于最優(yōu)組(p<0.05),這可能是因為肉中蛋白質(zhì)被降解為氨及胺類代謝產(chǎn)物的程度逐漸增大,使得揮發(fā)性鹽基氮值顯著升高[19]。初始時對照組與最優(yōu)組的TVB-N含量均小于10 mg/100 g,對照組在第8 d時TVB-N值高達(18.76±0.63) mg/100 g,而最優(yōu)組TVB-N值僅為(13.97±0.37) mg/100 g,說明最優(yōu)組對鹵鴨脖的 TVB-N值的增長有抑制作用。直到第15 d最優(yōu)組的TVB-N值僅為(20.86±0.79) mg/100 g,而對照組已達到(27.84±0.49) mg/100 g,表明最優(yōu)組合有效抑制了產(chǎn)胺類微生物的生長。這與測定的菌落總數(shù)趨勢相一致。因此,與對照組相比,最優(yōu)組合的復(fù)合保鮮涂膜液的保鮮效果較好。
圖4 最佳復(fù)配組合對鹵鴨脖冷藏期間的TVB-N值影響
2.5.5 最優(yōu)組合對鹵鴨脖冷藏期間色差值的影響 如圖5所示,更高的ΔE*表示與原始色差相比變化較大。對照組在第8 d時ΔE*值為1.50±0.14,第15 d時ΔE*值高達2.34±0.13,與初始色澤變化顯著(p<0.05)。而最優(yōu)組在冷藏第12 d仍能保持ΔE*值為1.40±0.04,最優(yōu)組合的復(fù)合涂膜液有效地抑制微生物的生長,減少色澤的波動。海藻酸鈉可食用膜使鴨脖表面更加鮮亮,這是因為可食用膜隔絕了氧氣進一步阻止了脂質(zhì)過氧化。第15 d時最優(yōu)組的顏色呈深褐色,ΔE*值為1.51±0.07,汁液流失較少,而對照組已長出可見菌斑。由此可見,最優(yōu)組合對延長鹵鴨脖貨架期有明顯效果,且不影響其外觀。
圖5 最佳復(fù)配組合對鹵鴨脖冷藏期間的色差值影響
通過正交試驗獲得了三種天然保鮮劑的最優(yōu)組合,結(jié)果表明復(fù)配使用后保鮮效果增強,天然保鮮劑Nisin 和納他霉素對海藻酸鈉可食用膜涂膜鴨脖的協(xié)同保鮮作用明顯,最優(yōu)組合為海藻酸鈉 1.0 g/100 mL、Nisin 0.9 g/100 mL、納他霉素0.18 g/100 mL。鹵鴨脖在涂膜后冷藏第15 d菌落總數(shù)對數(shù)值、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、pH、TBARS和色差值分別為(5.37±0.08)lg CFU/g、(20.86±0.79) mg/100 g、(5.85±0.06)、(2.68±0.08) mg/kg、(1.51±0.07),均顯著優(yōu)于對照組(p<0.05),最優(yōu)組合能有效抑制鴨脖腐敗變質(zhì),保持肉樣新鮮度,延長鹵鴨脖冷藏貨架期。