栗新峰,張 良,李芳芳,蘇占元,吳衛(wèi)宇,趙金松,,,*
(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;2.瀘州老窖集團(tuán)有限責(zé)任公司,四川瀘州 646000;3.四川國(guó)檢檢測(cè)有限責(zé)任公司,四川瀘州 646000)
原酒入庫(kù)或交易原酒前,需要對(duì)其進(jìn)行分類定級(jí)[1-2]。目前,我國(guó)原酒的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)沒有統(tǒng)一[3-4],如何準(zhǔn)確、科學(xué)、有效地評(píng)價(jià)原酒質(zhì)量成為今后研究的重點(diǎn)。
白酒的質(zhì)量差異主要是由酒中1%~2%的微量香味物質(zhì)決定的[5],研究者對(duì)其研究手段主要為感官評(píng)定法和色譜法。由于感官評(píng)定法容易受到主觀和客觀條件的影響[6-7],使得色譜法的檢測(cè)結(jié)果顯的更加嚴(yán)謹(jǐn)和科學(xué)。其中氣相色譜作為混合物的分離工具,對(duì)化合物的分離分析發(fā)揮了重要的作用[8-9],從1957年第一次實(shí)現(xiàn)氣相色譜和質(zhì)譜儀的聯(lián)用以來(lái)[10],氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在酒類領(lǐng)域開始了廣泛的應(yīng)用[11-14],但是常規(guī)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離能力差,靈敏度和準(zhǔn)確率低,僅靠提高柱效或提高柱選擇性又難以得到滿意的分析結(jié)果。與之不同的是氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(gas chromatography-quadrupole flight time mass spectra,GC-QTOF MS)因高配置的飛行時(shí)間質(zhì)譜有串聯(lián)其它質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜分析的特點(diǎn),再結(jié)合自身氣相色譜的高分離能力,使得GC-QTOF MS具有高分辨率、高靈敏度、高準(zhǔn)確率的優(yōu)勢(shì)。羅銘等[15]通過(guò)GC-QTOF MS分析了土壤中的多環(huán)芳烴和農(nóng)藥殘留,表明了該方法在痕量化合物檢測(cè)當(dāng)中具有高靈敏度和高可靠性。劉俊彥等[16]使用GC-QTOF MS對(duì)復(fù)雜體系中的微量苯甲醛、苯甲醇、苯乙酮與苯乙醛進(jìn)行了分析,結(jié)果表明GC-QTOF MS靈敏度高,且定量準(zhǔn)確,為GC-QTOF MS應(yīng)用于復(fù)雜體系中微量物質(zhì)的分析提供了一種新的方法。李曉潁等[17]通過(guò)GC-QTOF MS建立了152種常見農(nóng)藥的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)與二級(jí)譜圖庫(kù),提高了鑒定的可靠性并擴(kuò)大了農(nóng)藥的分析范圍,證明了該方法在復(fù)雜基質(zhì)中可以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。這些研究顯示,GC-QTOF MS在微量成分分析及風(fēng)格特色研究領(lǐng)域有很大的優(yōu)勢(shì),很適合像白酒這種復(fù)雜體系中微量物質(zhì)的準(zhǔn)確研究。目前為止通過(guò)GC-QTOF MS定性和定量分析白酒原酒中的風(fēng)味物質(zhì)并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)等分析方法建立原酒質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)體系的研究還未見報(bào)道。本研究旨在建立快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確且成本低的濃香型白酒原酒質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)方法。利用GC-QTOF MS強(qiáng)大的定性和定量能力在一定程度上可以很好地規(guī)避直接進(jìn)樣法樣品中微量成分難以檢測(cè)的難題,也避免了樣品前處理過(guò)程中微量物質(zhì)的損失、成本增加和時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。
本文采用直接進(jìn)樣法通過(guò)GC-QTOF MS對(duì)濃香型白酒原酒中的43種揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性和定量分析,考察其分析方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性,獲取指紋圖譜數(shù)據(jù),運(yùn)用因子分析結(jié)合感官品評(píng),以期建立濃香型白酒原酒質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)方法,對(duì)不同等級(jí)原酒進(jìn)行更準(zhǔn)確、科學(xué)、高效區(qū)分和評(píng)價(jià)。
10個(gè)不同等級(jí)濃香型原酒樣品 一級(jí)濃香原酒3個(gè)(NX1~NX3),二級(jí)濃香原酒3個(gè)(NX4~NX6)和三級(jí)濃香原酒4個(gè)(NX7~NX10),由四川原酒基金提供;叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸(內(nèi)標(biāo),色譜純,純度≥99.9%) 天津市津科精細(xì)化工研究所;甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、乙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、苯甲醛、糠醛、甲醇、2-丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、己醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、2-戊酮、3-羥基-2-丁酮、愈創(chuàng)木酚(標(biāo)準(zhǔn)品,色譜純,純度≥99.9%) 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司。
電子天平(220 g,0.1 mg) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Labserv-LS-0610干燥箱 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;7890B/7200Q-TOF氣相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、VF-WAXms色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國(guó)安捷倫科技公司;超純水處理系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司。
1.2.1 濃香型原酒感官品評(píng)鑒定 感官品評(píng)鑒定小組由1名國(guó)家級(jí)品酒師和3名品酒員組成,按照色澤(10分)、香氣(25分)、口味(50分)、風(fēng)格(15分),總分100分的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原酒樣品進(jìn)行打分,其中總分95分以上定為優(yōu)級(jí)原酒,90~95分定為一級(jí)原酒,85~90分定為二級(jí)原酒,80~85分定為三級(jí)原酒,80分以下定為四級(jí)原酒。
1.2.2 濃香型原酒的GC-QTOF MS分析
1.2.2.1 GC-QTOF MS參數(shù)設(shè)置 吳衛(wèi)宇等[18]的方法。進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣分流比:20∶1;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;高純He2載氣流速:1 mL/min;升溫程序:初始溫度35 ℃持續(xù)10 min,然后以2 ℃/min升溫到120 ℃,再以5 ℃/min升溫到200 ℃,最后以10 ℃/min升溫到245 ℃,持續(xù)40 min;GC-QTOF MS接口溫度:280 ℃;EI離子源電離能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;四級(jí)桿溫度:150 ℃;掃描質(zhì)量范圍:29~500 m/z。
1.2.2.2 定性和定量分析 用乙醇溶液配制酯類、酸類、醛類、醇類、酮類、酚類等43種風(fēng)味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制濃度為53.8~2427.5 mg/L。再用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液配制叔戊醇15.19 g/L、乙酸正戊酯15.10 g/L、2-乙基丁酸15.09 g/L的3種混合內(nèi)標(biāo)溶液。采用直接進(jìn)樣法對(duì)標(biāo)樣自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)和全掃描。然后利用計(jì)算機(jī)檢索NIST2012標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù),確定這43種風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間和特征碎片離子,選擇豐度高的碎片離子為定性離子進(jìn)行定性分析。以混合標(biāo)準(zhǔn)品中各組分與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)含量比值為橫坐標(biāo),各組分與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)計(jì)算得到43種物質(zhì)的回歸線性方程進(jìn)行定量分析。本文研究?jī)?nèi)容是在本課題組前期建立的GC-QTOF MS檢測(cè)白酒中揮發(fā)性風(fēng)味物方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,上述43種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及定性離子和定量回歸線性方程詳情請(qǐng)查閱本課題組已發(fā)表的研究成果論文[18]。
1.2.2.3 樣品測(cè)定 按照上述GC-QTOF MS參數(shù)設(shè)置,采用直接進(jìn)樣法,準(zhǔn)確量取5 mL基酒樣品,然后加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液,混勻后上機(jī)自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)。
1.2.3 GC-QTOF MS分析方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 按“1.2.2”的實(shí)驗(yàn)條件,分別從三個(gè)等級(jí)的濃香型原酒樣品中隨機(jī)各抽取一個(gè)酒樣按等體積1∶1∶1混合為一個(gè)酒樣,編號(hào)記為NX11。連續(xù)對(duì)其檢測(cè)6次,計(jì)算每種風(fēng)味物質(zhì)6次檢測(cè)結(jié)果的RSD,對(duì)其精密度進(jìn)行考察;取NX11酒樣分成6份進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算每種風(fēng)味物質(zhì)6次檢測(cè)結(jié)果的RSD,對(duì)其重復(fù)性進(jìn)行考察;在17 ℃密封儲(chǔ)存下分別于1、10、20、30、40、50、60 h取NX11酒樣進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算每種風(fēng)味物質(zhì)6次檢測(cè)結(jié)果的RSD,對(duì)其60 h內(nèi)的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。
因子分析[19]可以從一些具有相關(guān)性的指標(biāo)中,找出可能保留原始變量信息并且互相無(wú)關(guān)的少數(shù)綜合指標(biāo),從而實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維和簡(jiǎn)化,有利于后續(xù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。相對(duì)于傳統(tǒng)的原酒感官評(píng)價(jià)定級(jí)方法,通過(guò)因子分析將不同等級(jí)原酒之間的差異進(jìn)行評(píng)價(jià)可以有效地避免感官評(píng)價(jià)的主觀影響。
10個(gè)濃香型原酒樣品信息和感官品評(píng)結(jié)果見表1。
表1 原酒品評(píng)結(jié)果Table 1 The result of the evaluation of the base liquor
由感官品評(píng)專家小組對(duì)10個(gè)濃香型原酒樣品鑒定結(jié)果如表1顯示,NX1~NX3的總分在90~95分之間,評(píng)定為一級(jí)原酒。NX4~NX6的總分在85~90分之間,評(píng)定為二級(jí)原酒。NX7~NX10的總分在80~85分之間,評(píng)定為三級(jí)原酒。
按“1.2.3”的實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)GC-QTOF MS測(cè)定濃香型白酒原酒中43種揮發(fā)性風(fēng)味成分定性和定量分析的方法學(xué)進(jìn)行精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察,計(jì)算結(jié)果見表2。從表2可以看出,在精密度實(shí)驗(yàn)中43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量RSD范圍在0.21%~2.84%,相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍在0.00%~0.65%。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量RSD范圍在1.29%~2.98%,相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍在0.00%~0.84%。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量RSD范圍在0.81%~2.93%,相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍在0.00%~0.77%??傮w結(jié)果RSD≤2.98%,表明了該方法具有較好的精密度、重復(fù)性且在60 h內(nèi)較穩(wěn)定。
表2 GC-QTOF MS檢測(cè)原酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性Table 2 The accuracy,repeatability and stability of detection of volatile flavor substances in base liquor by GC-QTOF MS
續(xù)表
本研究選取了上述43種濃香型白酒原酒中含量占比大且是重要呈香呈味特征風(fēng)味物質(zhì)的共有成分,從10個(gè)濃香型原酒樣品中通過(guò)GC-QTOF MS對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析,結(jié)果見表3。
表3 10個(gè)濃香型原酒樣品中43種揮發(fā)性物質(zhì)成分定性和定量分析結(jié)果(mg/L)Table 3 Qualitative and quantitative results of 43 volatile substances in 10 Luzhou-flavor base liquor(mg/L)
續(xù)表
利用SPSS 21.0對(duì)10個(gè)原酒樣品中的43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成的10×43矩陣采用主成分的方法進(jìn)行因子分析。
剔除掉成份矩陣中特征值小于1的主成分中最大特征向量對(duì)應(yīng)的變量,然后重新進(jìn)行因子分析,重復(fù)有限次后保留了23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分,結(jié)果保留了甲醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、油酸乙酯、乙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、愈創(chuàng)木酚,其中醇類6種,酸4種,酯類8種,醛類4種、酚類1種。對(duì)10個(gè)原酒樣品中保留的23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分重新進(jìn)行主成分分析,分析結(jié)果見表4~表5。
表4 PCA總方差解釋Table 4 Total variance of principal component analysis
表5 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 5 Rotational component matrix
由表4可以看出,前3個(gè)主成分特征值大于1且累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.324%,選取前3個(gè)主成分能夠基本反映原指標(biāo)的大部分信息。由表5可以看出,戊酸乙酯、甲醇、庚酸乙酯、異丁醛、異戊醛、正己醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正戊醇、正丁醇和油酸乙酯在第1主成分上的載荷依次為0.982、0.939、0.922、0.917、0.900、0.887、0.886、0.820、0.818、0.807、0.721,載荷較高,相關(guān)性強(qiáng),集中反映了濃香型原酒中酯類、醇類和醛類風(fēng)味成分的信息。乙縮醛、乙醛、異戊醇、丁酸乙酯、異丁醇和己酸乙酯在第2主成分上的載荷依次為0.985、0.982、0.926、0.923、0.848、0.841,載荷較高,相關(guān)性強(qiáng),主要涵蓋了濃香型原酒中醛類、醇類和酯類風(fēng)味成分的信息。辛酸、戊酸、庚酸、愈創(chuàng)木酚和己酸在第3個(gè)主成分上的載荷依次為0.986、0.970、0.954、0.745、0.714,載荷較高,相關(guān)性強(qiáng),主要代表了濃香型原酒中酸類和酚類風(fēng)味成分的信息。
通過(guò)成分得分系數(shù)矩陣得出前3個(gè)主成分得分的表達(dá)式和主成分綜合得分評(píng)價(jià)式,如下。
F1=-0.004X1+0.16X2+0.153X3+0.046X4-0.016X5+0.138X6+0.147X7-0.027X8-0.003X9+0.012X10+0.136X11+0.038X12-0.005X13-0.046X14+0.085X15+0.125X16+0.065X17+0.016X18+0.018X19-0.026X20+0.002X21-0.02X22+0.037X23
F2=0.165X1-0.045X2-0.005X3+0.021X4+0.164X5+0.017X6+0.016X7+0.023X8+0.139X9+0.177X10-0.003X11+0.023X12+0.207X13+0.166X14-0.063X15-0.017X16+0.003X17-0.033X18+0.026X19+0.013X20-0.024X21-0.014X22-0.022X23
F3=-0004X1-0.022X2-0.083X3-0.059X4-0.009X5+0.001X6+0.020X7+0.044X8-0.007X9-0.046X10+0.053X11+0.005X12-0.082X13+0.074X14-0.015X15+0.016X16+0.008X17+0.227X18+0.112X19+0.159X20+0.237X21+0.263X22+0.100X23
F=(40.054F1+33.438F2+17.832F3)/91.324
通過(guò)上式,計(jì)算出10個(gè)基酒樣品的前3個(gè)主成分和主成分綜合值,見表6。
表6 主成分和主成分綜合值Table 6 Principal component values and composite principal component values
從表6可以看出,主成分綜合值F從大到小依次為0.98(NX3)、0.92(NX1)、0.31(NX2)、0.10(NX5)、0.10(NX6)、-0.09(NX4)、-0.49(NX9)、-0.55(NX10)、-0.57(NX8)、-0.71(NX7)。F值與感官定級(jí)結(jié)果94(NX3)、93(NX1)、90(NX2)、88(NX5)、88(NX6)、86(NX4)、82(NX9)、82(NX10)、81(NX8)、80(NX7)在數(shù)值上從大到小的順序一致,由此可見綜合值F越大,感官品評(píng)綜合得分越高,質(zhì)量等級(jí)就越好。根據(jù)表6中的數(shù)據(jù),做第一主成分對(duì)第二主成得分的投影圖,見圖1。
圖1 第一主成分對(duì)第二主成分得分PCA投影圖
由圖1可以看出,10個(gè)原酒樣品大體上分為三大類,其中NX1、NX3和NX2可以劃為一類,NX4、NX5和NX6可以劃為一類,NX7、NX8、NX9和NX10可以劃為一類,結(jié)果與專家組感官定級(jí)情況相符。同時(shí),也對(duì)未篩選前原始數(shù)據(jù)的第一主成分對(duì)第二主成分得分做投影圖,見圖2。
圖2 原始第一主成分對(duì)第二主成分得分PCA投影圖
如圖2所示,和圖1進(jìn)行對(duì)比分析,圖2與圖1結(jié)果類似,都能將10個(gè)原酒樣品分為三類,并且編號(hào)一致。結(jié)果再次表明了篩選出來(lái)的23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能較好地表征原始43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的信息,并能將該批次3個(gè)等級(jí)原酒進(jìn)行有效分類。
原酒樣品主成分綜合得分F值和對(duì)應(yīng)的感官品評(píng)綜合得分之間有良好的線性關(guān)系。以原酒樣品3個(gè)主成分綜合得分F值為自變量,感官品評(píng)綜合得分(Y值)為因變量做線性回歸分析。得出擬合函數(shù)為Y=8.2329F+86.4(R2=0.9801),在原酒樣品23種風(fēng)味物質(zhì)成分綜合得分F值和感官品評(píng)綜合得分之間建立了數(shù)學(xué)關(guān)系,通過(guò)原酒樣品的23種風(fēng)味物質(zhì)成分的含量就可以得出感官品評(píng)綜合得分對(duì)原酒樣品的3個(gè)等級(jí)進(jìn)行評(píng)判。
進(jìn)一步從本批次原酒樣品中隨機(jī)抽取已經(jīng)通過(guò)專家組感官品評(píng)定級(jí)的3個(gè)等級(jí)濃香型原酒樣品21個(gè),按照相同的實(shí)驗(yàn)條件和方法,代入上述公式,對(duì)濃香型原酒等級(jí)評(píng)判模型的準(zhǔn)確率進(jìn)行驗(yàn)證,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表7。
表7 原酒等級(jí)評(píng)判模型準(zhǔn)確率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 7 Statistical results of the accuracy of base liquor grade evaluation model
由表7可以看出該濃香型原酒等級(jí)評(píng)判模型相對(duì)于專家組感官品評(píng)定級(jí)有85.71%的準(zhǔn)確率,基本可以滿足對(duì)原酒樣品一、二、三等級(jí)的初步評(píng)判。
本文通過(guò)GC-QTOF MS對(duì)濃香型原酒樣品中的43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行定性和定量分析,在考察方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量和相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤2.98%,表明了該方法具有較好的精密度、重復(fù)性且在60 h內(nèi)較穩(wěn)定。
利用因子分析從43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分中篩選出了23種揮發(fā)性風(fēng)味組分:甲醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、甲酸乙酯、乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、油酸乙酯、乙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、愈創(chuàng)木酚,這23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能夠較好地代表原始的43種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的大部分信息,可以將該批次3個(gè)等級(jí)原酒進(jìn)行有效分類,和專家品評(píng)小組對(duì)10個(gè)濃香型白酒原酒樣品的感官品評(píng)鑒定結(jié)果一致。再進(jìn)一步以這23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前3個(gè)主成分的綜合得分F值為自變量,以感官品評(píng)綜合得分(Y值)為因變量做線性回歸分析,建立了濃香型原酒等級(jí)數(shù)學(xué)評(píng)判模型Y=8.2329F+86.4(R2=0.9801),準(zhǔn)確率驗(yàn)證為85.71%,基本可以滿足對(duì)此類濃香型原酒3個(gè)等級(jí)的初步評(píng)判。鑒于實(shí)驗(yàn)條件和酒樣有限,后續(xù)將繼續(xù)增大樣本量進(jìn)一步分析,以期分析結(jié)果更加完善和準(zhǔn)確。