李小蓉,郭 惠,龍 旭,劉江濤,劉靖麗,李佳佳,張永枚

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西西安 712046)

金絲桃苷(Hyperoside),又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷,是一種黃酮醇苷類(lèi)化合物,是金絲桃屬藥用植物的一種主要有效成分。近年來(lái),大量文獻(xiàn)報(bào)道其具有多種藥理學(xué)活性,如抗急性肝損傷[1]、抗炎[2]、抗抑郁、抗血栓、抗氧化應(yīng)激、抗菌、抗癌等。因此,對(duì)藥用植物或藥品中金絲桃苷的含量檢測(cè)具有非常重要的意義。

基于單壁碳納米管(SWCNTs)具有良好的催化活性、導(dǎo)電性和較大的比表面積等特性,本文采用SWCNTs修飾玻碳電極(GCE),構(gòu)建電化學(xué)傳感器,對(duì)中藥有效成分金絲桃苷的含量進(jìn)行檢測(cè),建立一種簡(jiǎn)單、高靈敏的金絲桃苷的電化學(xué)檢測(cè)方法,并用于實(shí)際樣品疏肝解郁膠囊中金絲桃苷的測(cè)定,以期為中藥有效成分檢測(cè)提供新技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金絲桃苷對(duì)照品(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;N,N-二甲基甲酰胺 分析純,天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司;SWCNTs 深圳市納米港有限公司;鐵氰化鉀、氯化鉀 分析純,上海化學(xué)試劑有限公司;甲醇 分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;疏肝解郁膠囊 成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 均為二次蒸餾水;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司;SG8200H超聲波清洗機(jī) 上海冠特超聲儀器有限公司;pHS-3C型精密pH計(jì) 上海日島科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 修飾電極的制備

1.2.1.1 SWCNTs的羧基化 精密稱(chēng)取2 g SWCNTs置于50 mL的小燒杯中,加入一定量36%的HCl,超聲6 h(40 kHz)后,用去離子水洗滌,直至洗出液的pH大于6.0為止。然后加入2 mol/L的HNO3溶液,靜置1 h后,在溫度為90 ℃的恒溫水浴鍋中放置10 h,接著超聲1 h(40 kHz),最后用去離子水沖洗SWCNTs至洗出液的pH為中性。在減壓真空干燥箱中于60 ℃干燥20 h,即得羧基化的SWCNTs[15]。

1.2.1.2 GCE的處理 將GCE(直徑3 mm)在麂皮上用0.5 μm的Al2O3拋光至鏡面,然后用二次蒸餾水清洗干凈,晾干。然后將其置于1.0×10-4mol/L K3[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)溶液中,掃描循環(huán)伏安(CV)圖。重復(fù)上述操作,直至得到對(duì)稱(chēng)且可逆的氧化還原峰,峰電位差小于80 mV,取出電極備用。

1.2.1.3 SWCNTs/GCE修飾電極的制備 稱(chēng)取羧基化的SWCNTs 2.0 mg,加入1 mL的N,N-二甲基甲酰胺,超聲3 h(40 kHz),得到均勻的分散液,精密移取一定體積的分散液,滴在處理好的GCE表面,空氣中自然晾干。

1.2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

1.2.2.1 不同電極面積的計(jì)算 在1.0×10-4mol/L K3[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)溶液中,采用計(jì)時(shí)庫(kù)侖法,得到裸GCE電極和SWCNTs/GCE電極的計(jì)時(shí)庫(kù)倫曲線(xiàn),根據(jù)計(jì)時(shí)庫(kù)倫曲線(xiàn)的Q-t數(shù)值,繪制Q-t1/2曲線(xiàn),得到不同電極的Q-t1/2曲線(xiàn)方程及線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)。依據(jù)不同電極Q-t1/2曲線(xiàn)的斜率和Anson 公式,可以計(jì)算出不同電極的面積。Anson公式的表達(dá)式為:

式中:n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)目,對(duì)K3[Fe(CN)6]溶液,n=1;F為法拉第電解常數(shù),F=96485C/mol,A為電極的表面積,c是溶液的濃度,D是擴(kuò)散系數(shù),在1.0×10-4mol/LK3[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)溶液中,D=7.6×10-6cm2/s;Qdl為雙電層的充電量,Qads為法拉第電荷。

1.2.2.2 修飾電極的電化學(xué)性質(zhì) 以濃度1.0×10-5mol/L金絲桃苷為測(cè)定液,采用CV法對(duì)裸電極和修飾電極進(jìn)行表征,并和裸電極相比較,以確定修飾電極的電化學(xué)性能。

1.2.3 金絲桃苷在修飾電極表面作用機(jī)制 為了研究金絲桃苷在傳感器表面的反應(yīng)機(jī)制,實(shí)驗(yàn)中考察了掃描速度對(duì)金絲桃苷的電化學(xué)行為的影響,研究掃描速度分別為0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30時(shí),金絲桃苷在傳感器上的峰電位和峰電流的數(shù)值,得到氧化峰電流及還原峰電流與掃描速度的關(guān)系,以確定其作用機(jī)制。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 以0.1 mol L-1的磷酸緩沖溶液(PBS)為介質(zhì),1.0×10-5mol/L金絲桃苷溶液作為測(cè)定液,固定掃描電位為-0.2～0.8 V,掃描速度為0.10 V/s,SWNTs用量為10 μL,采用CV法考察金絲桃苷溶液的pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時(shí)傳感器的響應(yīng)信號(hào);固定pH為6.0,考察SWCNTs用量分別為5、7、10、12、15、18 μL時(shí)對(duì)電極的修飾效果;SWNTs用量為10 μL,pH為6.0,采用i-t曲線(xiàn)法考察初始電位值分別為0.20、0.25、0.30、0.34、0.40、0.45 V時(shí)傳感器的響應(yīng)值。

1.2.5 電化學(xué)測(cè)量 實(shí)驗(yàn)中采用三電極系統(tǒng),以SWCNTs/GCE修飾電極或GCE為工作電極、鉑片為對(duì)極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。選擇SWCNTs用量分別為10 μL,以+0.34 V(vs. SCE)為工作電位,在0.1 mol/L PBS(pH=6.0)中記錄傳感器的背景電流;然后將傳感器浸入含濃度分別為3.0×10-9、7.0×10-9、1.0×10-8、3.0×10-8、7.0×10-8、1.0×10-7mol/L金絲桃苷溶液中記錄傳感器的響應(yīng)電流。兩次電流的差值即為傳感器對(duì)金絲桃苷的響應(yīng)電流。

1.2.6 樣品的處理 稱(chēng)取0.35 g疏肝解郁膠囊,置于50 mL小燒杯中,加入10 mL甲醇,超聲45 min,然后離心10 min,取上清液,過(guò)濾,重復(fù)上述提取過(guò)程3次,合并濾液,濃縮至10 mL。取所得液體10 μL,用緩沖溶液稀釋至100 mL作為待測(cè)液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均平行3次,所得數(shù)據(jù)經(jīng)CHI660E電化學(xué)工作站記錄和導(dǎo)入后,采用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極面積的測(cè)定結(jié)果

電極面積的大小直接影響到對(duì)傳感器的響應(yīng)信號(hào)及檢測(cè)的靈敏度,實(shí)驗(yàn)中計(jì)算了裸電極和修飾電極的面積,結(jié)果如圖1所示。根據(jù)圖1可得,裸GCE的Q-t1/2曲線(xiàn)線(xiàn)性方程為:Q(10-4C)=0.0279 t1/2(s1/2)+0.0104(r=0.999);SWCNTs/GCE修飾電極Q-t1/2曲線(xiàn)線(xiàn)性方程為:Q(10-4C)=0.4075 t1/2(s1/2)+2.2375(r=0.996);根據(jù)Anson公式計(jì)算出兩者的電極面積分別為0.10、1.36 cm2。表明和裸GCE相比較,SWCNTs/GCE電極的面積極大地增加,可以提高金絲桃苷檢測(cè)的靈敏度。

圖1 1.0×10-4mol/L K3[Fe(CN)6](含0.1mol/L KCl)在GCE電極(a)、SWCNTs/GCE電極(b)上的計(jì)時(shí)庫(kù)侖曲線(xiàn)(A)及Q-t1/2曲線(xiàn)(B)

2.2 金絲桃苷在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)研究了不同電極的電化學(xué)活性,考察了不同電極在1.0×10-5mol/L金絲桃苷溶液中上的循環(huán)伏安行為,結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出,在裸GCE電極上金絲桃苷出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰,但峰電流較小。在SWCNTs/GCE電極上金絲桃苷的氧化峰電流和還原峰電流急劇增加,氧化峰電流大約是裸電極的56倍,還原峰電流約是裸電極的38倍。峰電流的增大表明,SWCNTs能夠?qū)鸾z桃苷的電子轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用,具有較高的電催化活性,這主要是由于SWCNTs具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和較大的比表面積的原因。

圖2 1.0×10-5mol/L金絲桃苷在裸GCE(a)、SWCNTs/GCE電極(b)上的CV圖(A);在SWCNTs/GCE電極上,加入1.0×10-5mol/L金絲桃苷前(c)和后(d)的CV圖(B)

2.3 金絲桃苷在修飾電極表面作用機(jī)制

圖3展示了不同掃描速度下金絲桃苷的CV曲線(xiàn)。由圖3可以看出,隨著掃描速度的增加,氧化峰電流和還原峰電流逐漸增加。氧化峰電流及還原峰電流在一定范圍內(nèi)與掃描速度的平方根成正比,其線(xiàn)性關(guān)系分別為:ipa=93.4v1/2-6.1624(r=0.9844)和ipc=209.46v1/2-30.023(r=0.992),表明金絲桃苷在電極上的反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的過(guò)程。

圖3 1.0×10-5mol/L金絲桃苷在SWCNTs/GCE電極上不同掃描速度下的CV曲線(xiàn)(A)及氧化峰電流ipa-v1/2(a)和還原峰電流ipc-v1/2(b)的線(xiàn)性關(guān)系圖(B)

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 溶液pH的選擇 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著pH的變化,金絲桃苷在傳感器表面的電化學(xué)行為也發(fā)生了變化,如圖4所示,主要體現(xiàn)在隨著溶液pH的增加,金絲桃苷的氧化峰電流先迅速增加,當(dāng)pH達(dá)到6.0時(shí),氧化峰電流達(dá)到最大值;繼續(xù)增大pH,氧化峰電流又急劇降低。因此,綜合考慮氧化峰電流和峰形的因素,本實(shí)驗(yàn)中選取pH為6.0的PBS緩沖液的作為最佳底液。而隨著溶液pH的增加,氧化峰電位及還原峰電位均發(fā)生負(fù)移,說(shuō)明電極反應(yīng)過(guò)程有H+參與。

圖4 1.0×10-5mol/L金絲桃苷在SWCNTs/GCE電極上不同pH時(shí)的CV疊加圖

2.4.2 SWCNTs用量的選擇 實(shí)驗(yàn)中考察了SWCNTs用量對(duì)修飾電極性能的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)可知,氧化峰電流先隨著SWCNTs用量的增加而增加,當(dāng)SWCNTs用量為10 μL時(shí),峰電流達(dá)到最大;隨著SWCNTs用量的繼續(xù)增加,氧化峰電流迅速降低,這主要是因?yàn)楫?dāng)SWCNTs用量過(guò)多時(shí),修飾層的厚度就會(huì)增大,反而阻礙電子的傳遞。因此,實(shí)驗(yàn)選擇SWCNTs的用量為10 μL。

圖5 SWCNTs用量對(duì)金絲桃苷氧化峰電流的影響

2.4.3 電位的選擇 采用i-t曲線(xiàn)法測(cè)量時(shí),初始電位值對(duì)金絲桃苷的氧化電流會(huì)產(chǎn)生重要的影響。因此實(shí)驗(yàn)中在0.2～0.45 V的電位范圍內(nèi),研究了電位對(duì)金絲桃苷的氧化電流的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。當(dāng)電位在0.2～0.34 V變化時(shí),隨著電位的增加,氧化電流也增加,在0.34 V達(dá)到最大。此后,隨著電位的繼續(xù)增加,氧化電流迅速降低。因此實(shí)驗(yàn)中選擇金絲桃苷的測(cè)定電位為0.34 V。

圖6 電位對(duì)金絲桃苷氧化電流的影響

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,考察了氧化電流隨金絲桃苷濃度的變化情況,見(jiàn)圖7。結(jié)果表明,隨著金絲桃苷濃度的增加,氧化電流也隨之增加,在3.0×10-9～1.0×10-7mol/L范圍內(nèi),金絲桃苷濃度與氧化電流呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性回歸方程為i=1.2262C+0.0105(r=0.9921),檢出限(S/N=3)為2.41×10-9mol/L。與文獻(xiàn)已報(bào)道的檢測(cè)方法相比,具有較低的檢出限[16]。

圖7 金絲桃苷濃度與氧化電流的關(guān)系

2.6 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性對(duì)測(cè)量結(jié)果具有重要的影響,因此在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,研究了傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。每次使用后將該傳感器放在pH=6.0的磷酸緩沖溶液中,采用CV法在電位區(qū)間-0.8～0.8 V范圍內(nèi)掃描10圈,使修飾電極表面重新活化。采用該修飾電極對(duì)1.0×10-8mol/L金絲桃苷進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定,得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%。用同樣的方法分別制作3支修飾電極,對(duì)1.0×10-8mol/L金絲桃苷測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%,表明構(gòu)筑的傳感器重現(xiàn)性較好。通過(guò)分析該傳感器在儲(chǔ)存的過(guò)程中響應(yīng)信號(hào)的變化情況來(lái)探索其穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。將在室溫下放置15 d的電極,在同樣條件測(cè)定金絲桃苷,氧化電流電流仍能達(dá)到最初的95.6%,表示該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

表1 不同時(shí)間傳感器的響應(yīng)Table 1 The response of the sensor at different time

2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

2.8 實(shí)際樣品分析

利用制備的傳感器對(duì)疏肝解郁膠囊中的金絲桃苷進(jìn)行了加標(biāo)回收檢測(cè),在相同條件下平行檢測(cè)3次,取其平均值,以提高傳感器檢測(cè)的準(zhǔn)確性,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。傳感器對(duì)1.0×10-8mol/L金絲桃苷測(cè)定的回收率為103.0%～106.4%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～3.3%。結(jié)果表明,該傳感器可用于實(shí)際樣品中金絲桃苷的含量測(cè)定。

表2 疏肝解郁膠囊中金絲桃苷的檢測(cè) Table 2 Results of analysis of hyperoside in Shugan Jieyu capsule

3 結(jié)論

本文通過(guò)酸氧化法在SWCNTs表面引入功能基羧基,將其修飾在GCE表面,構(gòu)建了一種電化學(xué)傳感器用于金絲桃苷的檢測(cè)。該傳感器面積為1.36 cm2,面積較大,對(duì)金絲桃苷具有較好的電催化活性。對(duì)金絲桃苷檢測(cè)的線(xiàn)性方程為:i=1.2262C+0.0105(r=0.9921),檢出限為2.41×10-9mol/L。平均回收率為103.0%～106.4%,檢測(cè)結(jié)果的RSD為1.2%～3.3%,低于5%。該傳感器在金絲桃苷的檢測(cè)中具有線(xiàn)性范圍較寬、檢測(cè)限較低、制作簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。本研究為金絲桃苷的檢測(cè)提供了一種新的思路。