阮曉莉,冉軍艦,趙瑞香,*,李 剛,雷 爽,ZHU Yang

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.瓦赫寧根大學(xué)研究中心，格爾德蘭瓦赫寧根 5960AA)

細(xì)菌素是指某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類抗菌性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物[1],能夠有效抑制或殺滅致病菌和腐敗菌,近緣菌種產(chǎn)生的細(xì)菌素會(huì)呈現(xiàn)出較為狹窄的抑菌圈[2]。細(xì)菌素相較于抗生素更加高效,且在實(shí)際應(yīng)用中無(wú)毒副作用和耐藥性,某些產(chǎn)生菌在發(fā)酵過(guò)程中還能起到一定的保健作用,因此將細(xì)菌素應(yīng)用在食品領(lǐng)域中的前景可觀[3-4]。目前細(xì)菌素主要應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域，研制開(kāi)發(fā)能夠代替醫(yī)療保健劑的產(chǎn)品,雖然細(xì)菌素的種類繁多,但是在食品防腐劑方面應(yīng)用較少[5]。迄今為止僅有一種羊毛硫細(xì)菌素Nisin被世界上六十多個(gè)國(guó)家允許使用在食品防腐方面,絕大多數(shù)的細(xì)菌素尚在試驗(yàn)階段,主要是因?yàn)榛瘜W(xué)合成的細(xì)菌素成本高、性質(zhì)不穩(wěn)定而且天然細(xì)菌素的產(chǎn)量比較低,難以純化進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn),因此通過(guò)基因重組技術(shù)以期獲得大量純度較高的細(xì)菌素并將其應(yīng)用到實(shí)際當(dāng)中顯得尤為重要[6-7]。

細(xì)菌素分為四類:Ⅰ類為羊毛硫抗生素,Ⅱ類為含有非修飾氨基酸的多肽,Ⅲ類為大分子蛋白質(zhì),Ⅳ類為蛋白質(zhì)復(fù)合物[8]。Ⅱ類細(xì)菌素被分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc和Ⅱd四個(gè)亞類,其中研究較為深入的是Ⅱa類細(xì)菌素[9-10],但是其作為異源表達(dá)的對(duì)象時(shí)，最終獲得的抗菌性蛋白活性差異顯著,究其原因主要是Ⅱa類單肽鏈非修飾抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用[11],經(jīng)多年來(lái)研究人員對(duì)細(xì)菌素遺傳學(xué)的深入研究發(fā)現(xiàn)，將Ⅱb類細(xì)菌素進(jìn)行異源表達(dá)可以克服毒害宿主細(xì)胞的問(wèn)題[12]。乳酸菌作為世界上廣泛應(yīng)用的益生菌,目前對(duì)于其產(chǎn)生的Ⅱb類細(xì)菌素的研究相對(duì)較少,植物乳桿菌素PlnEF屬于Ⅱb類雙肽鏈非修飾細(xì)菌素,但天然的細(xì)菌素PlnEF不僅產(chǎn)量低而且難以分離純化,最實(shí)用、高效率的方法就是通過(guò)基因工程來(lái)解決此類難題。

表達(dá)質(zhì)粒pET含有強(qiáng)啟動(dòng)子使其具有強(qiáng)大的表達(dá)功能,并且本身攜帶6個(gè)組氨酸的His單抗標(biāo)簽,使融合蛋白能夠得到較好地鑒定與純化[13]。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)因其多方面的優(yōu)越性多年來(lái)廣泛應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域,其作為表達(dá)菌株具有清楚的遺傳背景、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且外源表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他宿主細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn),所以常作為生物技術(shù)研究的首選表達(dá)體系[14]。早在2004年,Park等[15]將導(dǎo)入有植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)谷氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得了重組谷氨酸脫羧酶蛋白的高效表達(dá),并證實(shí)該蛋白具有活性。龔鋼明等[16]將乳桿菌中亞硝酸鹽還原酶基因連接質(zhì)粒pET-32a(+)構(gòu)建表達(dá)載體,并成功導(dǎo)入受體細(xì)胞大腸桿菌中,使其大量克隆后表達(dá)的蛋白達(dá)到預(yù)期的生物特性。植物乳桿菌含有產(chǎn)生細(xì)菌素的基因,可依據(jù)植物乳桿菌抗菌特性探究其作為生物防腐劑的潛力[17]。對(duì)于表達(dá)系統(tǒng)的鑒定,比較常用的方法是將工程菌菌落通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因,確定目的基因是否成功導(dǎo)入質(zhì)粒載體,若想進(jìn)一步驗(yàn)證原核表達(dá)質(zhì)粒是否構(gòu)建成功,可提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,并將鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送入測(cè)序公司測(cè)序。不少研究者在此類分子生物學(xué)研究中采用了上述鑒定方法[18-20]。

本研究采用基因工程技術(shù),在大腸桿菌BL21中導(dǎo)入重組質(zhì)粒pET-28a-PL-plnEF構(gòu)建工程菌表達(dá)抗菌性蛋白,經(jīng)鎳柱純化以期獲取細(xì)菌素的高效表達(dá),對(duì)深入探究植物乳桿菌細(xì)菌素的生物特性以及開(kāi)發(fā)其作為食品防腐劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) 從水開(kāi)菲爾分離并于實(shí)驗(yàn)室保藏;表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)、指示菌株大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)、大腸桿菌BL21(EscherichiacoliBL21) 由河南科技學(xué)院生物技術(shù)試驗(yàn)室保存;SOB(Super Optimal Broth)培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司;MRS(Man-Rogosa-Sharpe)、LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基 所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;SanPrep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒 生工生物工程股份有限公司;膠回收試劑盒 OMEGA公司;Prestained DL 15000 DNA Marker、Prestained DL 2000 DNA Marker、2×Power Taq PCR MasterMix 北京百泰克生物技術(shù)有限公司;HisTrap HP親和色譜柱 GE Healthcare公司;基因組DNA的小量純化試劑盒、T4 DNA Ligase Buffer、限制性核酸內(nèi)切酶Xho I、Noc I、Premixed Protein Marker(Low) 日本TaKaRa公司。

VCX130超聲波細(xì)胞破碎儀 美國(guó)SONICS公司;PCR擴(kuò)增儀 Long Genes Instruments;ZHYW-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;Sigma3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;GelX1650凝膠成像儀 上海歐翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及異源導(dǎo)入

1.2.1.1 菌株的培養(yǎng)及DNA提取 取超低溫冰箱保存的植物乳桿菌菌種在平板中劃線,挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h,按1%的接種量于培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h作為種子液。使用TAKARA基因組DNA的小量純化試劑盒提取植物乳桿菌基因組DNA。

1.2.1.2 植物乳桿菌素plnEF基因擴(kuò)增 根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中報(bào)道的plnEF(432 bp)基因片段,選擇限制性核酸內(nèi)切酶Xho I、Noc I作為目的基因plnEF片段5′端和3′端的內(nèi)切酶位點(diǎn),在pET-28a(+)質(zhì)粒本身攜帶的His標(biāo)簽單抗,構(gòu)建含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體,蛋白優(yōu)化表達(dá)后可得到純度較高的細(xì)菌素。

根據(jù)目的基因序列利用prime5.0在線軟件設(shè)計(jì)引物,由武漢金凱瑞生物有限公司合成,堿基序列如下:前端引物plnEF-F(Xho I):5′-ATGCCTCGAGT GGGCATAGTTAAAA-3′;后端引物plnEF-R(Noc I):5′-TATGGATTCTCAGGTTGCCGCAAAA-3′,質(zhì)?？寺∥稽c(diǎn)如圖1。

圖1 質(zhì)粒pET-28a(+)克隆位點(diǎn)圖

以供體菌株植物乳桿菌中全基因組為模板,PCR擴(kuò)增目的基因,隨后采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物[21]。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性、55 ℃退火、72 ℃延伸各30 s,30個(gè)循環(huán)[22]。

1.2.1.3 純化目的基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有少量引物二聚體,需要將DNA進(jìn)行膠回收[23],目的在于分離這些基因片段,將凝膠中目的基因所在的區(qū)域切膠回收其中的基因片段,以達(dá)到純化目的基因的目的。膠回收后的樣品用1%的瓊脂糖凝膠驗(yàn)證目的基因是否已回收到及其片段大小是否正確。

1.2.1.4 構(gòu)建表達(dá)載體 將純化后的目的基因與提取出的pET-28a(+)質(zhì)粒分別用限制性核酸內(nèi)切酶Xho I、Noc I在保溫儀中37 ℃雙酶切3 h并驗(yàn)證[24]。酶切體系:10×QuickCut Green Buffer 5 μL;限制性核酸內(nèi)切酶Noc I、Xho I各1 μL;質(zhì)粒pET-28a(+)15 μL;加雙蒸水至50 μL。雙酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證分子量大小。將目的基因利用T4 DNA連接酶連接至質(zhì)粒并命名為pET-28a-PL-plnEF。

利用電穿孔儀選擇Bacteria模式Ecl2(2.49 kv,5.9 ms),將表達(dá)載體pET-28a-PL-plnEF導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌BL21并迅速加入1 mL SOB培養(yǎng)基,培養(yǎng)1 h后菌液高速離心余留150 μL培養(yǎng)基用于重懸菌體,涂于預(yù)熱好的含Kana抗生素的LB平板[25]。

1.2.1.5 BL21-pET-28a-PL-plnEF重組菌株鑒定 12 h后培養(yǎng)完成的LB平板上出現(xiàn)白色菌落,為了確認(rèn)目的片段已成功轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞BL21中,需要選擇陽(yáng)性單菌進(jìn)行PCR鑒定,此時(shí)所用引物無(wú)限制性酶切位點(diǎn),反應(yīng)條件參照1.2.1.2。

1.2.2 融合蛋白表達(dá)及驗(yàn)證

1.2.2.1 融合蛋白的表達(dá)及提取 為驗(yàn)證目的蛋白是由目的基因plnEF轉(zhuǎn)錄而成的,需要將空白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌作為對(duì)照。同時(shí)對(duì)成功構(gòu)建的工程菌BL21-pET-28a-PL-plnEF和對(duì)照組BL21-pET-28a誘導(dǎo)表達(dá)[23-24]。即在500 mL培養(yǎng)基中按1∶1000加入50 mg/mL Kana,分別將兩種工程菌以1%的比例轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基,繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)5 h后加入IPTG,IPTG作為誘導(dǎo)劑能夠啟動(dòng)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄,在30 ℃條件下誘導(dǎo)反應(yīng)12 h。若菌量比較少可以將菌液離心濃縮至兩管棄除上清液,按比例1∶20加入ddH2O重懸菌體,超聲破法處理菌液(超聲條件:300 W,時(shí)間6 min,超聲破碎3 s,停歇4 s,50個(gè)循環(huán)),取上清液再次離心用0.22 μm濾膜去除雜質(zhì),濾液收集用于SDS-PAGE蛋白驗(yàn)證。

1.2.2.2 融合蛋白的親和純化及鑒定 將1 mL HisTrap HP純化介質(zhì)裝柱,上方安裝0.22 μm的濾膜,首先用注射器取1 mL的蒸餾水緩慢流洗鎳柱10遍,其次用濃度為10 mmol/L的咪唑(imidazole buffer with saline,IBS)緩沖溶液沖洗十遍以上,以便將柱子中容易揮發(fā)的雜質(zhì)沖洗出來(lái)以達(dá)到平衡柱子的目的。將工程菌表達(dá)后得到的粗提液蛋白上樣于His Trap HP 2至3次,分別用1 mL 10、20、50、100、200、300、400、500 mmol/L咪唑洗脫蛋白,由預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,50 mmol/L咪唑可洗脫目的融合蛋白,對(duì)照組所得蛋白用50 mmol/L咪唑。SDS-PAGE(15%分離膠、5%濃縮膠)電泳鑒定。

1.2.3 抑菌性試驗(yàn) 為確定目的抗菌性蛋白的洗脫梯度及抑菌效力,以大腸桿菌JM109為指示菌株進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)。牛津杯法在LB平板中打孔,分別取工程菌BL21-pET-28a-PL-plnEF和對(duì)照組工程菌BL21-pET-28a預(yù)留的培養(yǎng)基上清液以及不同濃度的咪唑緩沖液沖洗出的蛋白濾液各100 μL加至孔中,正置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

為確定目的抗菌性蛋白的洗脫梯度及抑菌效力,以大腸桿菌JM109為指示菌株進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)。牛津杯法在LB平板中打孔,分別取工程菌BL21-pET-28a-PL-plnEF預(yù)留的培養(yǎng)基上清液、不同濃度的咪唑緩沖液沖洗出的蛋白濾液以及對(duì)照組工程菌BL21-pET-28a用50 mmol/L咪唑洗脫的蛋白濾液各100 μL加至孔中,正置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),每組做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示,采用SPSS(18.0)軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及異源導(dǎo)入

2.1.1 膠回收目的基因驗(yàn)證 如圖2所示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后已完全去除引物二聚體形成的非目的條帶,達(dá)到純化的目的。

圖2 膠回收目的基因驗(yàn)證結(jié)果

2.1.2 雙酶切目的基因、pET-28a(+)以及酶連產(chǎn)物驗(yàn)證 雙酶切目的基因僅切掉6個(gè)保護(hù)堿基,驗(yàn)證結(jié)果如圖3。一般試劑盒提取出的質(zhì)粒呈高度折疊狀態(tài),需要經(jīng)過(guò)酶切后再進(jìn)行電泳,以確定質(zhì)粒的實(shí)際大小。已知表達(dá)質(zhì)粒分子量為5369 bp,質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Xho I、Noc I切掉132 bp,瓊脂糖電泳結(jié)果如圖4顯示,質(zhì)粒分子量大小無(wú)明顯變化,在大約5000 bp的位置出現(xiàn)唯一且明顯的條帶,證明質(zhì)粒雙酶切成功。

圖3 雙酶切目的基因驗(yàn)證結(jié)果

圖4 雙酶切質(zhì)粒pET-28a(+)驗(yàn)證結(jié)果

連接產(chǎn)物驗(yàn)證結(jié)果如圖5,可明顯看到近6000 bp有一條帶,與預(yù)期酶連產(chǎn)物分子大小相符。

圖5 酶連產(chǎn)物驗(yàn)證結(jié)果

2.1.3 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒菌落PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,結(jié)果如圖6所示,出現(xiàn)唯一且較為明顯的目標(biāo)條帶,條帶位置預(yù)期值與目的基因plnEF426 bp大小相符,表明重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增效果良好,初步證明目的基因plnEF已整合到質(zhì)粒pET-28a(+)中[26-27],測(cè)序結(jié)果與plnEF序列一致。

圖6 菌落PCR鑒定

2.2 目的融合蛋白的純化

工程菌菌液采用超聲破碎法破碎細(xì)胞,釋放目的融合蛋白,高速離心獲得粗提液蛋白。經(jīng)不同濃度的咪唑鎳柱純化,收集洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定[28-29]。染色3 h脫色后,50 mmol/L咪唑溶液洗脫后呈現(xiàn)出一條分子量在14.3～20.1 kDa之間的蛋白條帶,基本與理論融合蛋白分子量15.6 kDa大小相符(圖7)。空白對(duì)照在50 mmol/L咪唑洗脫時(shí)沒(méi)有此蛋白條帶,表明該融合蛋白應(yīng)為目的蛋白,且能夠在50 mmol/L咪唑濃度下得到有效溶解,純化效果較好。

圖7 BL21-pET28a-PL-plnEF及對(duì)照組誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

2.3 抑菌性試驗(yàn)

如圖8所示,LB平板上出現(xiàn)明顯大小不同的抑菌圈,指示菌株濃度一定,抑菌圈大小與抗菌蛋白的抑菌效力有關(guān),依據(jù)平行實(shí)驗(yàn),平板中1至11抑菌圈平均直徑如表1所示。其中3號(hào)即50 mmol/L咪唑洗脫的目的融合蛋白抑菌效果最為明顯,說(shuō)明目的融合蛋白具有抗菌作用。由抑菌圈11可明顯看出50 mmol/L咪唑洗脫下的對(duì)照組工程菌蛋白沒(méi)有抑菌能力,且通過(guò)SDS-PAGE電泳結(jié)果泳道3和10對(duì)比得出,對(duì)照組工程菌BL21-pET-28a沒(méi)有產(chǎn)生50 mmol/L濃度的咪唑能夠有效洗脫的蛋白。結(jié)合SDS-PAGE電泳蛋白表達(dá)結(jié)果以及抑菌性試驗(yàn)分析可知,確定50 mmol/L的咪唑洗脫的融合蛋白,即為目的基因plnEF所表達(dá)的目的蛋白,且該蛋白具有較高的抑菌活性[30]。

圖8 BL21-pET-28a-PL-plnEF蛋白及對(duì)照組蛋白抑菌性圖

表1 抑菌試驗(yàn)中各抑菌圈直徑平均值

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中菌落直接PCR鑒定后將重組質(zhì)粒測(cè)序,不僅能降低實(shí)驗(yàn)成本,大大縮短試驗(yàn)時(shí)間,而且減少了實(shí)驗(yàn)操作中各種因試劑殘留對(duì)分子鑒定帶來(lái)的不利影響。在本實(shí)驗(yàn)中工程菌按1%的接種量?jī)H培養(yǎng)5 h進(jìn)行IPTG誘導(dǎo),蛋白獲得高效表達(dá),但不同誘導(dǎo)條件對(duì)重組融合蛋白的表達(dá)有很大影響。在本試驗(yàn)中若想使重組融合蛋白最大程度的表達(dá),需要對(duì)誘導(dǎo)劑在不同誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)環(huán)境、誘導(dǎo)濃度等條件下做進(jìn)一步的研究。

理論目的蛋白條帶為15.6 kDa,與SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果相符。通過(guò)抑菌試驗(yàn)結(jié)果可以明顯觀察到濃度為50 mmol/L的咪唑能有效洗脫該工程菌所表達(dá)的蛋白且該蛋白抑菌作用較強(qiáng),工程菌發(fā)酵上清液具有明顯抑菌效果,說(shuō)明發(fā)酵上清液中同樣含有該目的抗菌蛋白,依據(jù)抑菌圈直徑大小表明,50 mmol/L咪唑洗脫下來(lái)的目的蛋白與其發(fā)酵上清液相比抗菌效力更強(qiáng),本試驗(yàn)中的目的融合蛋白是以可溶性表達(dá)的形式在工程菌中進(jìn)行高效表達(dá),表明該蛋白對(duì)宿主細(xì)胞BL21沒(méi)有毒害作用。基于抑菌試驗(yàn)對(duì)該蛋白的抑菌性檢測(cè),植物乳桿菌plnEF基因片段編碼的多肽能夠在原核細(xì)胞中正確表達(dá),能夠作為潛在的食品生物防腐劑,可在不同條件下研究其抑菌活性和特性,將成為進(jìn)一步研究的方向。