劉 云,王宗義,高 哲,閆伯前,趙萌萌,韓 濤,*

(1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000;3.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

N-亞硝胺是世界公認(rèn)的四大食品污染物之一,具有強(qiáng)致癌性,會(huì)對(duì)人體造成較大危害。而影響N-亞硝胺生成的因素較多,如金屬離子[1]、紅血素[1-2]、pH[3]、溫度[4-5]、微生物[3]、食品添加劑[1,5]、脂肪[1,6]、蛋白質(zhì)[7]等。其中食品添加劑中的亞硝酸和由蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化得到的胺類(lèi)化合物是N-亞硝胺生成的兩個(gè)必要前體物質(zhì)[8]。亞硝酸通常在肉制品的生產(chǎn)加工過(guò)程中添加,以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生毒素,使肉制品具有良好的色澤并賦予產(chǎn)品典型的風(fēng)味,延長(zhǎng)貨架期[9],但同時(shí)亞硝酸也可與氮氧化物形成亞硝胺[10]。在肉制品加工及貯藏過(guò)程中,微生物大量繁殖,蛋白質(zhì)分解形成游離氨基酸,這些氨基酸直接或間接影響了肉的鮮度[11]、色澤[12]以及風(fēng)味[13-15]。如賴(lài)氨酸和精氨酸[16-17]具有輔助發(fā)色的作用,丙氨酸作為一種鮮味氨基酸[13],是影響肉質(zhì)的鮮美度的因素之一。同時(shí)某些微生物分泌的氨基酸脫羧酶與氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)形成相應(yīng)的生物胺,最終形成N-亞硝胺[18]。精氨酸、酪氨酸分別為精胺、酪胺的前體物質(zhì)[19],而脯氨酸是NPYR的前體物質(zhì),賴(lài)氨酸、丙氨酸、纈氨酸在一定條件下可以形成NDMA[7,20]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于食品中N-亞硝胺的研究集中在畜肉制品及水產(chǎn)品,主要由于這兩類(lèi)食品中富含蛋白質(zhì),容易產(chǎn)生N-亞硝胺。據(jù)報(bào)道豬肉、煙熏牛肉、咸肉等肉類(lèi)制品以及生魚(yú)、咸魚(yú)等魚(yú)類(lèi)制品等食品中均存在N-亞硝基化合物[21-22],主要為NDMA。國(guó)內(nèi)主要圍繞臘肉、香腸、腌制品等食品的N-亞硝胺含量進(jìn)行研究,臘肉[14]及中式香腸[23]中均檢出NDMA、NDEA和NPYR三種N-亞硝胺,N-亞硝胺總含量均在8～9 μg/kg,在腌肉[24]中檢出NDMA和NPYR兩種N-亞硝胺,平均含量分別為0.17和0.0013 μg/kg。國(guó)內(nèi)外對(duì)于減少N-亞硝胺的研究主要集中在尋找天然抑制劑,植物中存在的多種天然成分具有阻斷亞硝胺形成的作用,主要為酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)化合物等?？寡趸芰?qiáng)的物質(zhì)對(duì)N-亞硝胺的含量都有一定的減少作用,其中抗壞血酸是最大的阻斷者(阻斷率能達(dá)到90%)[25]。魏萌等[26]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果對(duì)蒸煮火腿中N-亞硝胺的含量具有顯著抑制作用。岳蘭昕等[27]發(fā)現(xiàn)櫻桃汁能有效阻斷豬肉火腿罐頭中NDMA、NDEA、NPYR的生成。尹立輝等[28]發(fā)現(xiàn)八角精油能將臘腸中NDMA含量控制在8.66 μg/kg左右,降低87%。李慕春[29]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)肉桂提取物、迷迭香提取物均對(duì)風(fēng)干腸中的N-亞硝胺具有顯著的阻斷作用。夏曉楠[30]發(fā)現(xiàn)鼠尾草有很強(qiáng)的抗氧化性,對(duì)肉制品中N-亞硝胺具有顯著的阻斷作用,且隨著添加量的增加,阻斷作用越顯著。朱倩穎等[31]發(fā)現(xiàn)多香果對(duì)肉制品中NDMA的含量具有明顯的抑制效果。茶多酚能顯著降低干腌培根中NDMA的含量[32]。

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill)為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實(shí)。已知全世界有25種,我國(guó)約有18種[33]。其果含有五味子素及維生素C、樹(shù)脂、鞣質(zhì)及少量糖類(lèi),具有一定的抗氧化功效,有強(qiáng)身健體之效[34]。谷艷菲等[35]通過(guò)研究五味子木脂素的抗氧化性能發(fā)現(xiàn),五味子木脂素、多糖等成分協(xié)同作用,抗氧化能力較強(qiáng)。皮子鳳等[36]研究表明五味子醇乙的抗氧化能力最強(qiáng)。五味子乙素能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),清除自由基,發(fā)揮抗氧化作用[37]。毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明:在實(shí)驗(yàn)大鼠口服單劑量2 g/kg的情況下無(wú)任何不良反應(yīng)。

目前針對(duì)于低溫貯藏下N-亞硝胺形成機(jī)制的研究較少,同時(shí)對(duì)于五味子能夠應(yīng)用于減少N-亞硝胺的研究尚未發(fā)現(xiàn)報(bào)道。尋找氨基酸與N-亞硝胺間的關(guān)系是明確N-亞硝胺形成機(jī)制的第一步,本研究以添加外源氨基酸為研究方法,初步判斷低溫條件下氨基酸和N-亞硝胺產(chǎn)生之間的關(guān)系,同時(shí)添加五味子觀察五味子對(duì)N-亞硝胺生成的影響,并且印證氨基酸與N-亞硝胺的關(guān)系,為進(jìn)一步探明氨基酸代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為N-亞硝胺的途徑提供基礎(chǔ),也為N-亞硝胺的調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精瘦肉(豬肉) 回龍觀龍華園美廉美超市;食鹽 中鹽北京市鹽業(yè)有限公司;白砂糖 北京糖業(yè)煙酒有限公司;白酒(52 °) 北京紅星二鍋頭酒廠;硝酸鈉(食品級(jí)) 北京化工廠;味精 上海太太樂(lè)食品有限公司;黑胡椒、生姜粉 北京吉得利食品有限公司;賴(lài)氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;五味子 延邊州和龍市八家子鎮(zhèn)仲鄉(xiāng)林場(chǎng);二氯甲烷、甲醇 色譜純,韓國(guó)德山藥品工業(yè);N-亞硝基二甲胺(NDMA)、N-亞硝基二正丙胺(NDPA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基哌啶(NPIP)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、N-亞硝基嗎啉(NMOR)、N-亞硝基甲乙胺(NMEA)、N-亞硝基二正丁胺(NDBA)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2000 mg/L) 美國(guó)O2si公司;NDMA-d6(N-亞硝基二甲胺-d6)甲醇溶液、NDPA-d14(N-亞硝基二正丙胺-d14)甲醇溶液、NPYR-d8(N-亞硝基吡咯烷-d8)甲醇溶液(均為1000 mg/L) 美國(guó)Accustandard Inc公司產(chǎn)品;Sep-Pak?plus AC-2固相萃取小柱 美國(guó)Waters公司;DB-WAXUI色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品;氫氧化鋇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JYS-A900九陽(yáng)絞肉機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司;Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;BF-2000氮吹儀 北京八方科技世紀(jì)有限公司產(chǎn)品;Agilent 7890B-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉丸的工藝流程 配方:原料肉以1 kg為基礎(chǔ),配方為:食鹽0.03 kg,糖0.04 kg,白酒0.025 kg,硝酸鈉0.5×10-3kg,味精0.003 kg,黑胡椒0.002 kg,生姜粉0.003 kg[10]。

操作要點(diǎn):將精瘦肉放至絞肉機(jī)中攪碎,按照配方分別加入鹽、糖、酒、硝酸鈉、味精、黑胡椒、生姜粉,攪勻按試驗(yàn)方案加入一定量的氨基酸、五味子,攪勻后手工制作肉丸(直徑約5 cm),用保鮮膜包好肉丸后置于4 ℃條件下進(jìn)行冷藏[30]。

1.2.2 試驗(yàn)分組 分別將1 mg/kg的賴(lài)氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸和1.2 g/kg的五味子粉分別加到肉泥中,依據(jù)配方1.2.1制作肉丸。以不加氨基酸和五味子的肉丸作為CK組,以添加氨基酸或者五味子的肉丸作為氨基酸組和五味子組。4 ℃冷藏定期測(cè)定第0、1、3、5、7、9 d的N-亞硝胺含量,每組樣品3個(gè)平行。將氨基酸試驗(yàn)組分別命名為賴(lài)氨酸組、精氨酸組、丙氨酸組、脯氨酸組、酪氨酸組、纈氨酸組,研究外源氨基酸的添加對(duì)N-亞硝胺含量的影響;將五味子組分別命名為五味子+CK組、五味子+賴(lài)氨酸組、五味子+精氨酸組、五味子+丙氨酸組、五味子+酪氨酸組、五味子+纈氨酸組,研究五味子對(duì)添加氨基酸的N-亞硝胺含量的影響。

1.2.3 N-亞硝胺含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別用二氯甲烷稀釋定值混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和3種定值內(nèi)標(biāo)溶液,得到200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和100 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,于棕色貯液瓶中-18 ℃儲(chǔ)存。用甲醇分別稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,得到濃度為1、0.1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液,和濃度為1 mg/L的NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8內(nèi)標(biāo)混合液。向混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液中加入適量的內(nèi)標(biāo)混合液,用二氯甲烷稀釋至濃度為50 μg/L,內(nèi)標(biāo)濃度為50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3.2 樣品前處理 稱(chēng)取10 g樣品于50 mL離心管中,加入50 μL 1 mg/L的內(nèi)標(biāo)混合液,靜置5 min,使內(nèi)標(biāo)溶液充分吸收,加入1 g氫氧化鋇,并加水至刻度線(xiàn),擰緊蓋子,于80 ℃烘箱中處理10 min,取出后渦旋混勻,再置于烘箱處理1 h,取出后以10000 r/min離心10 min,備用。將Sep-pak?plus AC-2小柱置于固相萃取裝置上,上接50 mL盛樣管,依次用6 mL二氯甲烷、甲醇和水活化小柱,加上清液,開(kāi)啟抽真空泵,控制樣品溶液約3滴每秒,待全部樣液流過(guò)小柱后,繼續(xù)抽干0.5 h。用5 mL二氯甲烷洗脫小柱,并收集流出液于10 mL離心管中,室溫氮吹至1 mL,過(guò)0.22 μm濾膜,于棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)[39]。

1.2.3.3 GC-MS/MS測(cè)定 色譜柱:DB-WAXUI柱(30 m×250 μm×0.25 μm);程序升溫:35 ℃保持1 min,以10 ℃/min升至90 ℃,再以30 ℃/min升至240 ℃,保持6 min;載氣:He(純度>99.999%),流速0.9 mL/min;進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣口溫度190 ℃;不分流進(jìn)樣。電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;傳輸線(xiàn)溫度250 ℃;四極桿溫度150 ℃;溶劑延遲5 min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè),參數(shù)列于表1[38]。

表1 測(cè)定8種N-亞硝胺和3種穩(wěn)定同位素標(biāo)記N-亞硝胺的MRM參數(shù)

按下式計(jì)算各種N-亞硝胺含量的增長(zhǎng)率(減少率)[39]:

式中:M0為CK組N-亞硝胺含量;Mt為樣品組N-亞硝胺含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013,計(jì)算平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差、增長(zhǎng)率(減少率),并作圖。以單因素方差分析ANOVA來(lái)檢測(cè)平均值之間的差異,以配對(duì)樣本t檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)組間差異,p<0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-亞硝胺線(xiàn)性方程

根據(jù)表2不同N-亞硝胺的線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)肉丸中N-亞硝胺進(jìn)行定量分析。最終在肉丸中檢出五種N-亞硝胺即NDMA、NDBA、NPIP、NPYR、NDPHA。

表2 不同N-亞硝胺的線(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 外源氨基酸對(duì)N-亞硝胺總含量的影響

2.2.1 添加外源氨基酸后N-亞硝胺總含量的變化 添加6種外源氨基酸后對(duì)貯藏9 d肉丸過(guò)程中進(jìn)行N-亞硝胺的測(cè)定,檢出的5種N-亞硝胺含量總和為N-亞硝胺總含量,結(jié)果如圖1所示。CK組中N-亞硝胺總含量整體呈下降趨勢(shì),添加氨基酸后N-亞硝胺總含量整體趨勢(shì)未發(fā)生改變,只有賴(lài)氨酸組的第3和第9 d,精氨酸組的第9 d,脯氨酸組的第0 d,纈氨酸組的第3 d其含量高于CK組,可能是由于添加6種外源氨基酸后NDPHA的含量下降的較為明顯,而NDPHA含量在N-亞硝胺總含量中占比較高,從而影響了N-亞硝胺總含量的變化。

圖1 添加不同種氨基酸后N-亞硝胺總含量在貯藏9 d中的變化

2.2.2 五味子對(duì)添加氨基酸后N-亞硝胺總含量的影響 同時(shí)添加氨基酸和五味子后,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),N-亞硝胺總含量的變化趨勢(shì)并未發(fā)生改變,整體呈下降趨勢(shì)(圖2)。通過(guò)計(jì)算N-亞硝胺總含量的減少率發(fā)現(xiàn),五味子的添加對(duì)酪氨酸組中N-亞硝胺總含量的抑制情況較為明顯,第1、5、7、9 d的減少率分別為4.83%、20.12%、20.21%、27.94%,并且有效降低了丙氨酸組在貯藏后期(第5～9 d)以及精氨酸組在貯藏中期(第3～7 d)的總含量,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)五味子的添加對(duì)CK組的抑制作用較小,只降低了第5 d的N-亞硝胺總含量。通過(guò)分析認(rèn)為添加氨基酸和五味子后,5個(gè)N-亞硝胺含量均有增加,此時(shí)五味子對(duì)N-亞硝胺的抑制作用凸現(xiàn)出來(lái)。說(shuō)明五味子可以減少低溫環(huán)境下調(diào)理肉丸中N-亞硝胺的含量,從而能夠延緩調(diào)理肉丸的腐敗,延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。

圖2 添加氨基酸和五味子后N-亞硝胺總含量在貯藏9 d中的變化

2.3 6種氨基酸對(duì)不同N-亞硝胺含量的影響

2.3.1 肉丸中N-亞硝胺含量的變化 通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),CK組(表3)中NDMA、NDBA、NPIP、NPYR的含量均在4.00 μg/kg以下,而NDPHA含量相對(duì)較高,大約為其他N-亞硝胺的10 倍以上,這與李慕春[40]的研究結(jié)果一致。調(diào)理肉丸中NDPHA含量整體呈下降趨勢(shì),其中第5 d有所上升,其他4種N-亞硝胺含量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。

表3 調(diào)理肉丸中N-亞硝胺含量在貯藏9 d中的變化(μg/kg)

由于NDPHA的含量在N-亞硝胺總含量中占比較高,因此NDPHA極大地影響了N-亞硝胺總含量的整體變化趨勢(shì),在儲(chǔ)存期內(nèi)先降后升再降的趨勢(shì),下降過(guò)程中可能是由于某些微生物對(duì)N-亞硝胺的形成產(chǎn)生了抑制作用[40]。

2.3.2 對(duì)添加賴(lài)氨酸的N-亞硝胺含量變化的影響 與表3相比,當(dāng)在肉丸中加入賴(lài)氨酸后(圖3A)NDMA、NDBA、NPIP、NDPHA含量在貯藏期5～9 d有所增加,說(shuō)明賴(lài)氨酸的添加對(duì)4 個(gè)N-亞硝胺有提高作用,同時(shí)文獻(xiàn)中認(rèn)為賴(lài)氨酸是N-亞硝胺的前體物質(zhì),如Warthesen等[40]的研究認(rèn)為賴(lài)氨酸可能是NPIP的前體物質(zhì),Drabik等[5]認(rèn)為賴(lài)氨酸是NDMA的前體物質(zhì),但在本研究中NDMA和NPIP含量的提高并不具有顯著性差異。

對(duì)比圖3A和圖3B,加入五味子后(圖3B)發(fā)現(xiàn),NDMA含量在第1、5、7 d減少率均在1.50%以下,其他4種N-亞硝胺在第0、3、5、9 d含量下降,降幅在10.54%～56.85%之間,無(wú)顯著性差異(p>0.05),本研究中發(fā)現(xiàn)五味子對(duì)降低添加賴(lài)氨酸后的N-亞硝胺含量作用明顯,其中對(duì)NDMA的作用稍弱,Ender等[7]中認(rèn)為賴(lài)氨酸可以形成NDMA,而在本研究中雖然有效果,但因顯著性不明顯故不能印證文獻(xiàn)中的結(jié)論,故在本試驗(yàn)中N-亞硝胺的生成與賴(lài)氨酸無(wú)關(guān)。

圖3 添加五味子前后賴(lài)氨酸組中不同N-亞硝胺含量在貯藏9 d的變化

2.3.3 對(duì)添加精氨酸的N-亞硝胺含量變化的影響 與表3 CK組相比,在貯藏期內(nèi),精氨酸添加后(圖4A)只有NDPHA含量整體下降,其他4種N-亞硝胺含量均有不同程度的提高。NDMA含量只有第0、7 d低于CK組,其他貯藏期分別增加32.27%(第1 d)、51.55%(第3 d)、32.99%(第5 d)、73.18%(第9 d),具有顯著性差異(p<0.05),NDBA含量的增加量為79.99%(第0 d)、27.31%(第3 d)、29.94%(第5 d)、26.22%(第9 d),N-亞硝胺含量增加較多的其次是NPYR,可認(rèn)為在整個(gè)儲(chǔ)存期內(nèi),精氨酸的添加促進(jìn)了NDMA和NPYR的形成,這與文獻(xiàn)[7]相符,Co?sson等[19]認(rèn)為精氨酸是Spm的前體物質(zhì),并且在一定條件下可以形成N-亞硝胺。

對(duì)比圖4A、圖4B可發(fā)現(xiàn),加入五味子后對(duì)NDMA和NPYR含量的抑制性較強(qiáng),貯藏期內(nèi)分別下降了12.21%(第1 d)、10.73%(第3 d)、1.50%(第5 d)、39.96%(第7 d)、28.37%(第9 d)和16.56%(第1 d)、35.51%(第3 d)、67.94%(第7 d)、6.63%(第9 d)。通過(guò)正反對(duì)比發(fā)現(xiàn),精氨酸的添加提高了NDMA和NPYR的含量,但NPYR組間并不存在顯著性差異(p>0.05),因此認(rèn)為NDMA的生成與精氨酸有關(guān)。

圖4 添加五味子前后精氨酸組中不同N-亞硝胺含量在貯藏9 d的變化

2.3.4 對(duì)添加丙氨酸的N-亞硝胺含量變化的影響 與表3 CK組相比,丙氨酸的添加(圖5A)提高了NDBA含量,貯藏期內(nèi)增加了104.75%(第1 d)、51.20%(第7 d)、91.67%(第9 d),但不具有顯著性差異(p>0.05),Ender等[7]認(rèn)為丙氨酸可以形成NDMA,但本研究中并未發(fā)現(xiàn)丙氨酸的添加對(duì)NDMA含量有提高作用,可能是由于試驗(yàn)溫度所導(dǎo)致。

與圖5A相比,加入五味子后(圖5B),NDBA和NPYR含量下降較多,降幅在7.38%～31.44%之間。由于并未顯著性降低NDBA、NPYR的含量,可認(rèn)為丙氨酸與N-亞硝胺之間無(wú)聯(lián)系。

圖5 添加五味子前后丙氨酸組中不同N-亞硝胺含量在貯藏9 d的變化

2.3.5 對(duì)添加脯氨酸的N-亞硝胺含量變化的影響 與表3 CK組相比,脯氨酸添加后(圖6A)明顯增加了NDBA含量,貯藏期內(nèi)分別增加了252.09%(第0 d)、83.42%(第1 d)、28.01%(第3 d)、51.35%(第5 d)、55.28%(第7 d)、291.61%(第9 d),與CK組相比均具有顯著性差異(p<0.05),含量增加的其次是NPIP,增長(zhǎng)率為3.44%(第1 d)、7.45%(第3 d)、130.35%(第9 d),只有第9 d存在顯著性差異(p<0.05),脯氨酸是NPYR的重要前體物質(zhì)[5],但本研究中由于儲(chǔ)存溫度較低,因此并未發(fā)現(xiàn)NPYR含量有變化。

與圖6A相比,五味子添加后(圖6B),NDBA、NPIP、NPYR的含量均有一定程度的減少,其中NDBA含量在整個(gè)貯藏期內(nèi)均有不同程度的下降,減少率分別為16.93%(第0 d)、27.88%(第1 d)、29.47%(第3 d)、24.57%(第5 d)、17.78%(第7 d)、18.05%(第9 d),具有顯著性差異(p<0.05),NPIP次之。結(jié)合表3、圖7A和圖7B發(fā)現(xiàn),脯氨酸的添加會(huì)提高NDBA的含量。

圖6 添加五味子前后脯氨酸組中不同N-亞硝胺含量在貯藏9 d的變化

2.3.6 對(duì)添加酪氨酸的N-亞硝胺含量變化的影響 與表3 CK組相比,添加酪氨酸后(圖7A),NDBA含量顯著性增加(p<0.05),貯藏期內(nèi)分別增加了56.22%(第0 d)、31.78%(第1 d)、14.15%(第3 d)、22.70%(第5 d)、93.89%(第7 d)、161.97%(第9 d),含量增加的其次是NPIP。與圖7A相比,五味子的添加(圖7B)降低了NPIP和NPYR的含量,降幅最高分別為34.47%和53.22%,不具有顯著性差異(p>0.05)。綜合分析酪氨酸的添加對(duì)N-亞硝胺含量無(wú)明顯提高作用。

圖7 添加五味子前后酪氨酸組中不同N-亞硝胺含量在貯藏9 d的變化

2.3.7 對(duì)添加纈氨酸的N-亞硝胺含量變化的影響 與表3 CK組相比,纈氨酸的添加(圖8A)使NDBA含量在貯藏期內(nèi)分別增加了43.53%(第0 d)、45.09%(第1 d)、55.73%(第3 d)、36.96%(第5 d)、54.75%(第7 d)、28.36%(第9 d),但不具有顯著性差異(p>0.05),其他N-亞硝胺均僅有一天的含量有所增加,脯氨酸是NPYR的重要前體物質(zhì)[5],但本研究中由于儲(chǔ)存溫度較低,因此并未發(fā)現(xiàn)NPYR含量有變化。

與圖8A相比,添加五味子后(圖8B),五種N-亞硝胺的變化趨勢(shì)并未發(fā)生明顯改變,NPYR和NDBA含量降低,NPYR含量減少率分別為20.64%(第1 d)、8.17%(第3 d)、33.34%(第5 d)、18.42%(第7 d)、28.30%(第9 d),但只有第9 d具有顯著性差異(p<0.05),NDBA含量減少率為31.77%(第1 d)、16.94%(第3 d)、2.15%(第5 d)、15.27%(第9 d),但并無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

圖8 添加五味子前后纈氨酸組中不同N-亞硝胺含量在貯藏9 d的變化

2.4 6種氨基酸對(duì)同種N-亞硝胺含量變化的影響

2.4.1 不同氨基酸對(duì)NDMA含量的影響 由圖9A可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),CK組NDMA含量變化整體呈先升后降趨勢(shì),與CK組相比,精氨酸組的NDMA含量顯著性增加。由圖9B可看出,各組整體仍呈上升趨勢(shì),五味子+CK組的含量并未降低,其他6組NDMA的含量在添加五味子之后均有不同程度的下降,其中五味子+精氨酸組的含量降低較為明顯,其次是五味子+酪氨酸組。因此認(rèn)為NDMA的生成與精氨酸有關(guān)。

圖9 氨基酸與五味子的添加對(duì)NDMA含量的影響

2.4.2 不同氨基酸對(duì)NDBA含量的影響 由圖10A可知,CK組的NDBA含量整體先升后降,添加外源氨基酸后波動(dòng)較大。添加脯氨酸、酪氨酸后,NDBA含量在貯藏期內(nèi)均有提高,增幅均在14.15%以上,通過(guò)比較2種氨基酸對(duì)NDBA含量的影響,發(fā)現(xiàn)脯氨酸對(duì)NDBA的提高作用較大并具有顯著性差異。當(dāng)添加五味子后(圖10B),五味子+CK組的含量降低,在第5 d下降明顯,而其他6組NDBA的整體波動(dòng)稍平穩(wěn),且含量均有不同程度的減少,其中五味子+脯氨酸組的NDBA含量下降明顯,其次是五味子+丙氨酸組和五味子+酪氨酸組。綜合圖10A、圖10B結(jié)果,可認(rèn)為NDBA的生成與脯氨酸有關(guān)。

圖10 氨基酸與五味子的添加對(duì)NDBA含量的影響

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NDPHA的含量在N-亞硝胺總含量中占比較高,但6種外源氨基酸的添加對(duì)NDPHA含量并無(wú)提高作用,因此添加氨基酸后,N-亞硝胺總含量降低;同時(shí)發(fā)現(xiàn)五味子對(duì)NDPHA含量無(wú)抑制作用,因此對(duì)N-亞硝胺總含量無(wú)抑制作用。而同時(shí)添加氨基酸和五味子后,5種N-亞硝胺含量均有增加,此時(shí)五味子對(duì)N-亞硝胺的抑制作用產(chǎn)生,推測(cè)其或與氨基酸產(chǎn)生一定協(xié)同作用,。

為延長(zhǎng)豬肉的貨架期,本研究模擬生豬肉在市場(chǎng)中的儲(chǔ)存條件,將貯藏溫度設(shè)置為4 ℃進(jìn)行N-亞硝胺形成過(guò)程的研究。蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸等以及生物胺,在有足夠量硝酸鹽存在或高溫條件下都可產(chǎn)生N-亞硝胺[41]。研究顯示,脯氨酸、丙氨酸及在微生物還有酶的作用下產(chǎn)生生物胺(腐胺、尸胺),會(huì)形成NDMA和NDEA[42]。丙氨酸、纈氨酸主要形成NDMA,脯氨酸會(huì)形成NPYR[7,20]。Drabik等[43]研究了腌肉中脯氨酸和羥脯氨酸在N-亞硝胺的形成過(guò)程中的作用,發(fā)現(xiàn)N-亞硝胺的形成與脯氨酸含量和處理溫度(>200 ℃)直接相關(guān);文獻(xiàn)[7,42]指出,脯氨酸可亞硝基化形成亞硝基脯氨酸,再脫羧形成大量的NPYR。但本研究在低溫(4 ℃)條件下未發(fā)現(xiàn)脯氨酸和NPYR之間存在相應(yīng)的聯(lián)系,僅觀察到精氨酸和脯氨酸的相關(guān)作用,即低溫下精氨酸能提高NDMA含量,而脯氨酸能提高NDBA含量。做出以下推測(cè),精氨酸和脯氨酸對(duì)N-亞硝胺的影響較為直接,因此即使在低溫下依然可以觀察到兩種氨基酸對(duì)N-亞硝胺的影響,而其他四種氨基酸對(duì)N-亞硝胺的影響較弱,只有在外界環(huán)境達(dá)到一定程度時(shí)才會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化。高溫條件下,微生物及酶的作用加快,促進(jìn)丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸向NDMA和NPYR的轉(zhuǎn)化,因此在低溫條件下并不存在這一轉(zhuǎn)化規(guī)律。

紅冬蛇菰提取物[44]、柑橘皮黃酮類(lèi)化合物提取液[45]、阿魏酸[46]等具有強(qiáng)抗氧化性活性,均有抑制亞硝化反應(yīng)的作用。五味子中同樣含有多種抗氧化成分,本研究中初步觀察到五味子對(duì)NPIP含量有降低作用;同時(shí)還觀察到五味子對(duì)添加精氨酸、脯氨酸后的NDMA、NDBA含量有明顯的降低作用。說(shuō)明五味子可以減少低溫環(huán)境下生肉中N-亞硝胺的含量,從而能夠達(dá)到保鮮的作用,延長(zhǎng)生肉貨架期。

4 結(jié)論

本研究旨在初步確定氨基酸與N-亞硝胺之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)肉制品中NDMA的生成與精氨酸有關(guān),NDBA的生成與脯氨酸有關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)五味子可以降低NPIP的含量。對(duì)于精氨酸與NDMA、脯氨酸與NDBA間的具體轉(zhuǎn)化過(guò)程可進(jìn)一步研究,同時(shí)五味子降低NPIP的含量的具體路徑仍有待進(jìn)一步探討。