劉宇琪,郝利民,魯吉珂,崔 燕,鄭志強(qiáng),張黎明,賈士儒,*

(1.天津科技大學(xué),工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2.軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所,北京 100010;3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450001)

靈芝(Ganodermalucidum)是一種具有極高藥用價(jià)值的靈芝屬真菌,首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有扶正固本、延年益壽等功效[1]。靈芝多糖是靈芝活性成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用[2]。邢會軍等[3]研究發(fā)現(xiàn),靈芝多糖可以促進(jìn)凋亡基因和抑制抗凋亡基因的表達(dá)來達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞增殖的目的。Zhang等[4]研究了靈芝多糖對胰島細(xì)胞的影響,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可以顯著逆轉(zhuǎn)四氧嘧啶對胰島細(xì)胞造成的損傷,增加血清胰島素的水平,降低血糖水平,同時(shí)抑制自由基的生成。

靈芝孢子(Ganodermalucidumspore)是由靈芝發(fā)育后期彈射出來的生殖細(xì)胞,也稱擔(dān)孢子,具有大量的遺傳物質(zhì)[5]。靈芝孢子具有多種化學(xué)成分,包括多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)、甾醇類、生物堿、脂肪酸、維生素、無機(jī)元素、腺苷等[6]。多糖包括以β-(1→6)-D-葡聚糖為主鏈的多糖、線性(1-3)-α-D-葡聚糖和以β-糖苷鍵鏈接的中性雜多糖[7]。唐慶久等[8]研究發(fā)現(xiàn),靈芝孢子粉堿提多糖可以刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和大量NO,明顯增強(qiáng)對乳膠顆粒的吞噬功能。張麗霞等[9]的研究也證明了靈芝孢子粉多糖可以刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,提高吞噬能力。馮鵬等[10]發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉多糖可通過刺激免疫細(xì)胞,提高小鼠免疫系統(tǒng)功能,達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的目的，同時(shí),靈芝孢子粉多糖還具有抗氧化能力。馮翠萍等[11]研究發(fā)現(xiàn),靈芝孢子粉多糖對DPPH自由基和NaNO2具有一定清除能力,且多糖濃度越高,清除能力越強(qiáng)。

靈芝和靈芝孢子粉多糖的研究已有大量報(bào)道,但對同源靈芝子實(shí)體和孢子粉多糖的分離純化及體外抗氧化活性的對比研究相對較少。本文對同源靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉粗多糖進(jìn)行分離純化和體外抗氧化活性的對比研究,以期為探究靈芝多糖的活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實(shí)體(Ganodormalucidum)、靈芝孢子粉(Ganodormalucidumspore powder) 安徽金寨喬康藥業(yè)有限公司;2,2′-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;乙醇 天津市四通化工廠;氯仿 天津市元立化工有限公司;苯酚、濃硫酸、葡萄糖、氯化鈉、葡萄糖醛酸、過硫酸鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵 均為分析純。

WND-200型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司;JA12002型電子天平 上海精科天平儀器廠;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SH-D(III)型真空泵 河南予華儀器有限公司;ALPHA 1-4/LD型冷凍干燥機(jī) 德國CHRIS公司;BT102S型數(shù)控計(jì)滴自動部分收集器 保定雷弗流體科技有限公司;QL-902型漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì) 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;TDA-8002型恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝子實(shí)體粗多糖的提取 將靈芝子實(shí)體于60 ℃下烘干,粉碎。取適量靈芝子實(shí)體粉末按料液比1∶6 (W/V)加入95%乙醇浸泡24 h,以去除部分色素和醇溶性雜質(zhì)。浸泡后減壓抽濾,將濾渣于60 ℃下烘干備用。精確稱量干燥后的子實(shí)體粉末,按料液比1∶20 (W/V)加入蒸餾水,90 ℃水浴提取2 h,提取2次,抽濾并合并濾液,真空濃縮至約50 mL。加入3倍體積的95%乙醇,使得乙醇終濃度為75%,4 ℃沉淀12 h,4000 r/min離心15 min,棄去上清液。用95%乙醇再次洗滌沉淀并離心,將沉淀冷凍干燥后得子實(shí)體粗多糖(GLP)[12]。

1.2.2 靈芝孢子粉粗多糖的提取 稱取一定量靈芝孢子粉,按料液比1∶20 (W/V)加入蒸餾水,90 ℃水浴提取12 h,抽濾并合并濾液,將濾液真空濃縮至約50 mL。將靈芝孢子粉浸提液依照提取靈芝子實(shí)體多糖的方法進(jìn)行乙醇沉淀、冷凍干燥,得到靈芝孢子粗多糖(GLSP)[13]。

1.2.3 DEAE-650離子交換柱分離 采用Sevage法[14]對GLP和GLSP除蛋白,去除蛋白和氯仿相,收集水相,重復(fù)此步驟至蛋白層不再出現(xiàn)。收集水相,采用AB-8大孔吸附樹脂除色素。收集樣品,冷凍干燥。稱取除蛋白并脫色的多糖樣品50 mg,充分溶解于5 mL蒸餾水中,上樣于DEAE-650纖維素層析柱中,依次使用蒸餾水、0.2、0.4和0.6 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,自動收集器每5 mL收集1管。用苯酚-硫酸法測定管中的多糖含量。以收集的管數(shù)為橫坐標(biāo),490 nm處吸光度值為縱坐標(biāo),繪制DEAE-650離子交換柱層析洗脫曲線。依據(jù)洗脫峰型,合并相同組分,濃縮,凍干。

1.2.4 多糖含量 本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[15]。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.15 g/L)的制備:取葡萄糖(AR)于105～110 ℃下烘干至恒重,精確稱取0.15 g葡萄糖,先取少量蒸餾水溶解,然后加水定容至1000 mL,4 ℃保存。

苯酚試劑(6%)的制備:稱取6.0 g重蒸酚,用蒸餾水溶解并定容至100 mL,制成6%苯酚溶液。

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中并標(biāo)號,將每個(gè)試管補(bǔ)水至總體積為2 mL,以2 mL蒸餾水為空白對照。分別向每支試管中加1.0 mL 6%苯酚試劑,混勻,再向每個(gè)試管加5 mL濃硫酸,混勻,室溫下放置20 min,在490 nm下測定吸光度,以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo),以O(shè)D490為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=5.48762x-0.00457,R2=0.99798)。

1.2.4.2 多糖含量的測定 配制適當(dāng)濃度的待測品溶液,取待測樣品1 mL于試管中,加入1 mL蒸餾水,以2 mL蒸餾水為空白對照。分別向每支試管中加1 mL苯酚試劑,混勻,立即加5 mL濃硫酸,混勻,室溫下放置20 min后測定波長490 nm下的吸光度,根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.5 體外抗氧化活性的測定

1.2.5.1 ABTS+自由基清除能力的測定 參考林戀竹等[16]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將等體積7.4 mmol/mL的ABTS和2.6 mmol/mL的過硫酸鉀溶液混合,室溫避光下靜置12～16 h,制成ABTS儲備液。用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋儲備液,使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02,制成ABTS工作液。取不同質(zhì)量濃度的純化多糖樣品以及VC溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)各1 mL,加入ABTS工作液6 mL,混合均勻,室溫下靜置6 min,測定734 nm下的吸光度,以VC為陽性對照。根據(jù)式(1)計(jì)算ABTS自由基清除率:

式(1)

式中:Ai為樣品組吸光度;Aj為樣品本底吸光度(以等體積蒸餾水代替ABTS工作液);A0為空白對照組吸光度(以等體積蒸餾水代替多糖樣品溶液)。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除能力根據(jù)Gong等[17]的方法稍作修改。取不同濃度多糖樣品及VC溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)各1 mL,分別加入1 mL 0.5 mmol/mL DPPH溶液、10 mL 60%乙醇,混合均勻,在室溫下靜置30 min,測定517 nm下的吸光度,以VC為陽性對照。根據(jù)式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率:

式(2)

式中:Ai為樣品組吸光度;Aj為樣品本底吸光度(以等體積無水乙醇代替DPPH溶液);A0為空白對照組吸光度(以等體積蒸餾水代替多糖樣品溶液)。

1.2.5.3 羥基自由基清除能力 根據(jù)Liu等[18]的方法稍作修改。取不同濃度樣品及VC溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)各1 mL,加入5 mmol/mL FeSO4溶液2 mL,蒸餾水2 mL,5 mmol/mL水楊酸-乙醇溶液2 mL以及5 mmol/mL H2O2溶液2 mL,混合均勻,室溫下放置30 min,測定510 nm下的吸光度,以VC為陽性對照,按式(3)計(jì)算羥基自由基清除率:

式(3)

式中:Ai為樣品組吸光度;Aj為樣品本底吸光度(以等體積蒸餾水代替H2O2溶液);A0為空白對照組吸光度(以等體積蒸餾水代替多糖樣品溶液)。

1.2.5.4 還原能力 根據(jù)Fan等[19]的實(shí)驗(yàn)方法稍作修改。取不同濃度樣品及VC溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)各1 mL,加入1%(W/V)鐵氰化鉀溶液1 mL、pH6.6的磷酸緩沖液1 mL,混合均勻,50 ℃水浴反應(yīng)20 min,加入10%(W/V)三氯乙酸2 mL,3000 r/min離心10 min,取上清液2 mL加入蒸餾水2 mL、0.3%(W/V)三氯化鐵0.4 mL,混合均勻,50 ℃水浴反應(yīng)10 min,測定700 nm下的吸光度,以VC為陽性對照。根據(jù)式(4)計(jì)算還原能力:

還原能力=A1-A2

式(4)

式中:A1為樣品組吸光度;A2為樣品本底吸光度(以等體積蒸餾水代替三氯化鐵溶液)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù),結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD),采用Origin 8.5對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLP和GLSP DEAE-650離子交換樹脂洗脫曲線

采用DEAE-650離子交換樹脂對靈芝子實(shí)體粗多糖(GLP)和靈芝孢子粉粗多糖(GLSP)進(jìn)行分離純化,結(jié)果分別如圖1和圖2所示。用水和NaCl溶液洗脫,均得到兩種組分,分別為水洗脫得到的多糖(GLP-1和GLSP-1)和0.2 mol/L NaCl洗脫得到的多糖(GLP-2和GLSP-2)。

圖1 靈芝子實(shí)體多糖(GLP)DEAE-650洗脫曲線

圖2 靈芝子孢子粉多糖(GLSP)DEAE-650洗脫曲線

2.2 體外抗氧化活性分析

2.2.1 ABTS+自由基清除能力測定結(jié)果 無色的ABTS經(jīng)過硫酸鉀氧化后可以形成穩(wěn)定的藍(lán)綠色水溶性ABTS+自由基(ABTS+·),在734 nm下有特征吸收峰,抗氧化劑與ABTS+·反應(yīng)可使之褪色,根據(jù)褪色情況可判斷樣品抗氧化能力[20]。

圖3為四種純化多糖樣品(GLP-1、GLSP-1、GLP-2和GLSP-2)的ABTS+自由基清除能力結(jié)果。由圖3可知,五種樣品均有一定的ABTS+自由基清除能力,且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),多糖濃度越高,ABTS+自由基清除率越高,其中GLP-2對ABTS+自由基的清除能力最強(qiáng)。GLP-1的ABTS+自由基清除能力最低,在1.0 mg/mL時(shí)為63.16%,GLSP-1在1.0 mg/mL時(shí)ABTS+自由基清除能力為75.84%,GLSP-2在1.0 mg/mL時(shí)ABTS+自由基清除能力為80.27%。在0.2～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)GLP-2對ABTS+自由基的清除率幾乎均在95%以上,與VC相當(dāng)。

圖3 GLP-1、GLP-2、GLSP-1、GLSP-2對ABTS+自由基的清除能力

2.2.2 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果 DPPH自由基是一種相對穩(wěn)定的自由基,其可以接收電子或氫自由基而成為穩(wěn)定的分子,所以被廣泛應(yīng)用于測定自由基的清除能力[17]。DPPH自由基的醇溶液呈紫色,在517 nm下有最大吸收波長,且吸光度與濃度呈線性關(guān)系。向反應(yīng)體系中加入具有清除自由基能力的樣品,可以結(jié)合DPPH自由基,使之?dāng)?shù)量減少,溶液顏色變淺,吸光度減小,由此可判斷DPPH自由基清除能力[21]。

圖4為四種純化多糖在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)對DPPH自由基清除能力的結(jié)果。四種純化多糖對DPPH自由基的清除能力隨濃度升高基本沒有變化。四種純化多糖對DPPH自由基的清除能力均低于VC,GLP-2的DPPH自由基清除能力略高于其他三種純化多糖,且在0.4 mg/mL之后清除率基本不變,在1.0 mg/mL時(shí),清除率為75.88%。GLP-1對自由基的清除能力隨濃度的升高而有小幅波動,在1.0 mg/mL時(shí)清除率為60.57%。GLSP-1對DPPH自由基的清除能力與GLP-1相近,均在樣品濃度范圍內(nèi)有小幅變化,在1.0 mg/mL時(shí)清除率為54.98%。GLSP-2在0.2～0.6 mg/mL的濃度范圍內(nèi),對DPPH自由基清除能力沒有明顯變化,在0.6～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)的清除能力有小幅下降。

圖4 GLP-1、GLP-2、GLSP-1、GLSP-2對DPPH自由基的清除能力

2.2.3 羥基自由基清除能力測定結(jié)果 羥基自由基(·OH)是免疫活動中產(chǎn)生的副產(chǎn)物,存在時(shí)間短,是最活潑的自由基之一,可以損傷生物大分子,如核酸、脂質(zhì)或氨基酸,從而損害人類健康[22]。FeSO4和H2O2反應(yīng)會生成·OH,水楊酸能夠與之結(jié)合,生成紫色產(chǎn)物,在510 nm波長處有最大吸收。通過比色法測定樣品對·OH的清除率,進(jìn)而分析其抗氧化能力[23]。

圖5為四種純化多糖的羥基自由基清除能力。由圖可以看出,除GLSP-1外,其他三種純化多糖的羥基自由基清除能力均隨著各樣品濃度的增加而提高,在1.0 mg/mL時(shí),GLP-1、GLP-2和GLSP-2的羥基自由基清除能力分別為64.28%、81.55%和61.99%。在0～0.6 mg/mL的樣品濃度范圍內(nèi),GLSP-1的羥基自由基清除能力逐步提高,在0.6 mg/mL時(shí)為56.50%,在0.6～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi),則由56.50%逐步下降至52.64%。這表明,在一定濃度范圍內(nèi)的GLSP-1對羥基自由基的清除能力隨多糖濃度提高而提高,超出這一范圍之后則清除能力有所下降。整體來看,GLP-1、GLSP-1和GLSP-2對羥基自由基的清除能力相差不大,GLP-2的羥基自由基清除能力要顯著(p<0.05)高于其他三種純化多糖。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),四種純化多糖的羥基自由基清除能力均低于VC,其中GLP-2最高,相較于其他三種多糖與VC更為接近。

圖5 GLP-1、GLP-2、GLSP-1、GLSP-2對羥基自由基的清除能力

2.2.4 還原能力測定結(jié)果 還原性通常與還原酮的存在有關(guān),還原酮可以提供氫電子,中斷自由基連鎖反應(yīng)來達(dá)到抗氧化的目的。還原酮還可以與一些過氧化物的前體物反應(yīng),阻止過氧化物的形成[24]。樣品中的抗氧化劑可以將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+可以與三氯化鐵結(jié)合生成普魯士藍(lán),普魯士藍(lán)在700 nm處有最大吸收峰。以Fe3+還原為Fe2+的量即可判斷樣品的還原能力。

由圖6可知,四種純化多糖均有一定還原能力,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。整體來看,除GLP-2外,GLP-1、GLSP-1和GLSP-2三種純化多糖還原能力相差不大,在1.0 mg/mL時(shí),這三種純化多糖還原能力依次為0.283、0.471和0.291,均低于VC,而GLP-2還原能力整體均高于其他三種多糖,在1.0 mg/mL時(shí)其還原能力為0.728。

圖6 GLP-1、GLP-2、GLSP-1、GLSP-2還原能力

3 討論與結(jié)論

本文主要對靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉中的粗多糖進(jìn)行了提取,并采用DEAE650離子交換柱利用水和不同濃度NaCl對其洗脫進(jìn)行分離。從靈芝子實(shí)體粗多糖(GLP)和靈芝孢子粉粗多糖(GLSP)中均分離出兩種多糖,分別為水洗脫得到的純化多糖(GLP-1、GLSP-1)和0.2 mol/L NaCl洗脫得到的純化多糖(GLP-2、GLSP-2)。4種純化多糖均具有一定抗氧化能力,其中GLP-2的ABTS+自由基清除率、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原能力均高于GLP-1、GLSP-1和GLSP-2,特別是其ABTS自由基清除率高達(dá)98.09%,與VC相當(dāng)。對比Fan等[19]提取的靈芝粗多糖在濃度為1.5 mg/mL時(shí),對DPPH自由基的最高清除率為63.7%,而GLP-2在濃度為0.4 mg/mL時(shí),對DPPH自由基的清除率可達(dá)75.88%。同時(shí),Tan等[25]提取的靈芝粗多糖在濃度為2 mg/mL時(shí),對羥基自由基的清除率約為41.05%,而GLP-2在濃度為1.0 mg/mL時(shí),對羥基自由基的清除率為81.55%,由此推測,純化靈芝多糖的DPPH清除能力和羥基自由基清除能力可能高于靈芝粗多糖。

通過對靈芝子實(shí)體和孢子粉純化多糖體外抗氧化活性的對比研究,可以看出,同源的靈芝子實(shí)體和孢子粉多糖的抗氧化活性存在著較大差異,這可能與多糖的組成、結(jié)構(gòu)等的差異有關(guān),未來應(yīng)對多糖組成、結(jié)構(gòu)等與其抗氧化活性之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究,為食藥用菌多糖的研究與應(yīng)用提供更多參考。