王 宇,王柏輝,楊明陽,杜 瑞,蘇 琳,趙麗華,田建軍,靳 燁

(內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

內蒙古絨山羊是我國優(yōu)良的絨肉兼用型地方品種,相比綿羊肉,山羊肉脂肪含量低,蛋白含量高,更有益于人體健康,肌內脂肪的含量對肌肉嫩度、風味和多汁性具有重要影響,Chartrin等[1]研究表明,胸肌中脂質含量從1.7%增加到8.5%會增加鴨肉的亮度值、黃度值、蒸煮損失、嫩度和風味;肉類脂肪酸種類在烹飪過程中的氧化穩(wěn)定性中起著重要作用,影響肉的嫩度、風味和多汁性[2]。

目前內蒙古絨山羊飼養(yǎng)模式主要有放牧、舍飼和放牧+舍飼三種模式[3]。對絨山羊的研究主要集中在生產性能和疾病預防、養(yǎng)殖管理等方面。萬里強等[4]研究表明放牧山羊的生產性能受山羊有效的采食量、放牧季節(jié)和可食植物營養(yǎng)價值等因素的影響;畢臺飛等[5]研究表明舍飼山羊的產肉性能優(yōu)于放牧和放牧補飼,而放牧補飼山羊產絨性能高于其他放牧方式,可能是高運動量和優(yōu)良的牧草造成的。目前,對絨山羊肌肉脂肪代謝和沉積變化的研究較少。不同放牧區(qū)域牧草的多樣性和新鮮度不同,Scollan等[6]研究表明牧草種類的多樣性和新鮮度及牧草攝入量和攝入時間的延長均可增加肌肉中n-3系列多不飽和脂肪酸的沉積。脂蛋白脂酶(lipoprteinlipase,LPL)可水解血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯為游離脂肪酸和甘油,而產生的游離脂肪酸被運送到不同組織中氧化供能或作為脂肪合成的原料,對調控脂肪沉積具有重要的作用[7];硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)是催化飽和脂肪酸合成單不飽和脂肪酸的限速酶,影響肌肉中脂肪酸的組成,SCD基因的高表達有利于脂肪的沉積[8]。Zhang等[9]研究表明SCD和LPL基因表達量的上調,會提高肌肉中肌內脂肪含量的沉積。Dervishi等[10]研究表明羔羊肉中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)、飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的含量和n-6/n-3值與SCD和LPL的基因表達量密切相關。

本試驗主要通過測定山地放牧和草地放牧絨山羊的營養(yǎng)指標、肌肉脂肪酸含量和脂肪代謝基因mRNA的表達量,分析不同放牧條件下絨山羊肌肉的脂肪代謝和沉積變化,并建立脂肪代謝基因與脂肪和脂肪酸沉積間的聯(lián)系,旨在了解絨山羊脂肪沉積規(guī)律和脂肪調控的機制,增加肌內脂肪和有益脂肪酸的沉積量,減少低營養(yǎng)價值脂肪含量的沉積,從而提高脂肪的利用率。以期為今后通過調控脂肪代謝基因的表達來提高絨山羊肌內脂肪和脂肪酸的沉積,從而為改善羊肉的營養(yǎng)價值和品質提供參考,同時提高對內蒙古絨山羊這一優(yōu)良的絨肉兼用型地方品種的保護。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絨山羊的飼養(yǎng) 在陰山山脈中部的大青山地區(qū),氣候類型為典型的溫帶大陸性氣候,年降雨約為380 mm,大青山草原是典型荒漠化草原,山地放牧(1800 m以上)選擇在大青山山腰處,攝食植物包括黃芩、沙棘、秦艽等；草場放牧(1500 m以下) 選擇在大青山地區(qū)的草原上,牧草類型為蒙古蔥、蒺藜、芨芨草、堿韭等[11];甲醇、正己烷(均為色譜純)、三氯甲烷、三氯化硼-乙醚絡合物、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、硫酸、無水乙醚、氯仿、異丙醇、無水乙醇 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;37種脂肪酸甲酯的混標 Sigma公司;RNase-free 水 北京天根生物技術有限公司;瓊脂粉 天津市風船化學試劑科技有限公司;核酸染料 北京百泰克生物技術有限公司;焦碳酸二乙酯 Intrivogen公司;RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq? Version2.0、Preme Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMII 大連寶生物工程有限公司。

SXT-02索氏抽提器 上海洪紀儀器設備有限公司;KDY-9830凱氏定氮儀 北京市通潤源機電技術有限責任公司;KDN-D20D消化爐 上海精隆公司;Trace 1300氣相色譜質譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HJ-6型多頭磁力攪拌加熱器 江蘇榮華儀器制造有限;HH-4水浴鍋 上海?，攲嶒炘O備有限公司;GRX-9053A 型熱空氣干燥箱、SX2-4-10箱式電阻爐 上海一恒科技有限公司;ZHJH-C1112C超凈臺 上海智城分析儀器制造有限公司;Eppendorf5430R低溫臺式冷凍離心機 北京百晶生物科技有限公司;BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司;Mini-sub Cell GT Cel水平電泳槽、GelDoc XR+凝膠成像分析儀、CFX96TM Real-TimePCR儀 美國Bio-rad;Veriti PCR儀 美國Applied Biosystems。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 在內蒙古土默特左旗大青山牧區(qū),隨機選擇草場放牧和山地放牧條件下發(fā)育正常、健康的1.5歲絨山羊各12只,將該24只絨山羊屠宰后,取背最長肌50 g于-20 ℃保藏待用,取背最長肌10 g于液氮中保存,并置于實驗室-80 ℃保藏待用。

1.2.2 營養(yǎng)指標的測定 肌肉中蛋白質根據國標GB 5009.5-2016[12]采用凱氏定氮儀進行測定;肌肉中水分根據國標GB 5009.3-2016[13]采用直接干燥法進行測定;肌肉中脂肪根據國標GB 5009.6-2016[14]采用索氏抽提法進行測定;肌肉中灰分根據國標GB 5009.4-2016[15]采用直接灰分法進行測定。

1.2.3 羊肉中脂肪酸的測定 根據王柏輝等[16]的方法對脂肪酸進行提取:稱取碎肉樣5 g并加氯仿-甲醇混合液(2∶1,V/V),振搖2 h,浸泡過夜后用G3漏斗過濾,濾液中加5 mL 20%氯化鈉溶液,靜止分層,下層的氯仿層即為脂肪提取液。經無水硫酸鈉脫水后,40 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮得到脂肪。然后加0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液5 mL,70 ℃回流5 min,進行脂肪皂化,隨后加5 mL三氟化硼乙醚溶液,70 ℃回流2 min,進行脂肪甲酯化。最后加2 mL正己烷,70 ℃回流1 min,再加5 mL飽和NaCl溶液,靜置10 min,吸取1 mL正己烷層用0.22 μm有機濾膜過濾于進樣瓶中,進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件:色譜柱:反式色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm),載氣為氦氣,載氣流速為1 mL/min,進樣口溫度:240 ℃,進樣量為1 μL,分流比為100∶1。采用程序升溫:初始溫度為60 ℃,保持1 min,然后以20 ℃/min的速度升至120 ℃,保持1 min;再以5 ℃/min的速度升至240 ℃,保持15 min。

MS條件:離子源溫度為300 ℃,傳輸線溫度240 ℃,質量掃描范圍50～500 (m/z),溶劑延遲時間:4 min。

1.2.4 引物合成 引物序列如表1,LPL、SCD 由上海生工生物工程有限公司設計并合成,β-action作為管基因。

表1 實時定量引物

1.2.5 脂肪基因表達量的測定

1.2.5.1 RNA提取與反轉錄 稱取適量樣品于干凈的研缽中,多次加液氮且研磨樣品至粉狀用于RNA提取,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的質量。樣品RNA的最終濃度均為500 ng/μL。使用RT-qPCR的試劑盒將提的RNA反轉錄為cDNA[8],最后置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 實時定量PCR 本試驗按照CFX96TM Real-Time PCR Detection System進行操作。以反轉錄得到的cDNA為模板,使用CFX96TM Real-Time PCR儀進行實時定量PCR擴增。

實時定量PCR反應體系如表2所示。

表2 實時定量PCR反應體系

實時定量PCR擴增反應條件:預變性95 ℃,30 s;變性95 ℃,5 s,退火60 ℃,30 s,延伸72 ℃,30 s(變性、退火和延伸35個循環(huán));延伸72 ℃,10 min。

1.2.6 相關性分析 相關性采用SPSS 19.0 軟件中的雙變量相關分析(Pearson),在SPSS中導入變量數據,依次點擊“分析-相關-雙變量”,選擇變量導入變量框,并勾選Pearson選項框進行分析,顯著性p<0.05表示相關性顯著,p<0.01表示相關性極顯著。

1.3 數據分析

使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用Excel 2003軟件進行圖表處理。差異性采用單因素方差(One Way ANOVA)分析進行LSD和Duncan多重比較,相關性采用雙變量相關分析(Pearson)。

2 結果與分析

2.1 不同放牧條件下絨山羊營養(yǎng)指標的差異性分析

由表3可知,不同放牧條件下絨山羊的水分、灰分和蛋白質的含量均無顯著差異(p>0.05),而山地組肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)含量顯著高于草地組(p<0.05),這可能與山羊攝入的牧草類型和活動量不同有關,蔣建生[17]研究表明坡度40度以上的草地雜草繁茂,灌叢居多,在陡坡草地上山羊表現得比在平緩草地上更活躍且食欲更旺盛。逯來章等[18]研究表明高海拔地區(qū)低氧寒冷,藏羊皮下脂肪層厚,可以增強御寒能力。趙國華等[19]研究表明亞高山草甸草地是優(yōu)質的放牧地,雖然產草低,但草質好,適口性好,營養(yǎng)豐富,具有顯著的“三高一低”(粗脂肪高)的特點。本試驗的絨山羊肌內脂肪含量約在3.99%～5.61%之間,Hopkins等[20]研究指出就羊肉的肌內脂肪范圍,感官性狀模型指出最高脂肪水平(18%)總體喜愛程度比最低脂肪水平(2%)高出13%,并且消費者滿意的肌內脂肪含量最低為5%,這與山地組肌內脂肪含量更為接近。汪踔[21]研究表明肌內脂肪含量影響肉的多汁性、嫩度和風味,適度的脂肪沉積使肌肉細嫩多汁,香味濃郁。

表3 不同放牧條件下絨山羊營養(yǎng)指標的差異性分析

2.2 不同放牧條件下絨山羊肌肉中脂肪酸含量的差異性分析

由表4可知,草地組及山地組絨山羊肌肉中脂肪酸主要以棕櫚酸、硬脂酸和油酸為主,分別為92.42%、87.88%，其含量油酸>棕櫚酸>硬脂酸的趨勢,這與王柏輝等[16]對蘇尼特羊的研究結果一致,但絨山羊三種脂肪酸的總比例高于蘇尼特羊,原因可能是品種不同導致的。草地組單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)含量顯著高于山地組(p<0.05);山地組PUFA含量顯著高于草地組(p<0.05)；SFA含量在兩組中無顯著差異(p>0.05)。

表4 不同放牧條件下絨山羊肌肉中脂肪酸組成的差異性分析

在SFA中,兩種放牧條件下絨山羊肌肉中SFA均以棕櫚酸和硬脂酸為主,草地組癸酸含量顯著高于山地組(p<0.05);其他脂肪酸含量在兩組中差異均不顯著(p>0.05)。

在MUFA中,山地組反油酸含量顯著高于草地組(p<0.05);草地組油酸含量顯著高于山地組(p<0.05),王志武等[22]研究表明油酸能降低膽固醇在血液中的含量,減少其在血管上的沉積,有預防動脈硬化的作用;豆蔻油酸和棕櫚油酸含量在兩組中無顯著差異(p>0.05)。

在PUFA中,山地組反亞油酸、亞油酸、α-亞麻酸和CLA的含量均顯著高于草地組(p<0.05),這可能與山羊攝入的牧草類型和活動量的不同有關。張東杰[23]研究表明天然草地各類型中高寒草原類牧草飼料品質最好,其次是低平地草甸類、高寒草甸類、溫性荒漠類、溫性荒漠草原類、溫性草原類,表明山地牧草品質優(yōu)于草地牧草。山地組絨山羊的運動量大于草地組,漆艷娥等[24]研究表明運動能增加腸道菌群的多樣性,厚壁菌門和瘤胃球菌含量增加,擬桿菌門和乳酸桿菌科含量下降。王柏輝等[25]研究表明羊肉中CLA和α-亞麻酸與瘤胃球菌屬存在顯著正相關,而與擬桿菌屬存在顯著負相關;反油酸與擬桿菌屬存在顯著負相關,這與本試驗結果相一致。兩組的CLA含量有差異可能與瘤胃微生物群體的損傷以及SCD基因表達的抑制有關[26]。亞油酸作為風味物質分解合成的重要底物,對羊肉的風味形成起著重要作用[27]。亞麻酸具有降血壓、抗動脈粥樣硬化和益智等作用。趙天章[28]研究表明羊肉中含有高含量的CLA,遠高于豬肉和禽類,是人類獲得CLA的主要食物來源之一。草地組花生三烯酸和花生四烯酸的含量均顯著高于山地組;Urrutia等[29]研究表明飼喂高水平的α-亞麻酸會降低肌肉組織中花生三烯酸和花生四烯酸的含量,但低水平的α-亞麻酸飲食會增加花生四烯酸的含量。山地組二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)含量顯著高于草地組(p<0.05),而二十碳五烯酸(docosahexenoic acid,EPA)含量在兩組中無顯著差異(p>0.05)。EPA和DHA具有降血膽固醇、提高人體免疫力、增加肌肉重量和減少脂肪組織等有益功能[30]。畜禽肉的脂肪酸組成受飲食中脂肪酸組成的影響,產生上述結果的原因可能是山地牧草中含有的n-3PUFA含量高于草地組,使山地山羊肌肉中沉積較多的α-亞麻酸。Scollan等[6]研究表明草類植物含有高比例的(50%～75%)總脂肪酸為α-亞麻酸,而α-亞麻酸的延長和去飽和作用會增加肌肉中EPA和DHA的合成。兩組的EPA含量無顯著差異可能是由于α-亞麻酸向其長鏈PUFA產物的轉化率是有限的[31]。山地組n-3 PUFA顯著高于草地組(p<0.05);山地組n-6/n-3 PUFA值顯著低于草地組(p<0.05),比值為3.34,符合營養(yǎng)專家的推薦值n-6/n-3 PUFA≤4[26]。n-6/n-3PUFA值是影響人體健康的重要因素,Simopoulos[32]研究表明飲食中適當的n-6/n-3 PUFA值能預防人類許多慢性疾病的發(fā)生,如心血管疾病,癌癥以及炎癥和自身免疫疾病等,這進一步表明山地放牧組羊肉的營養(yǎng)價值較高。

2.3 不同放牧條件下肌肉中脂肪代謝基因的表達量

SCD和LPL是調控機體脂肪沉積的重要因子。由圖1可知,草地組SCD基因表達量顯著高于山地組(p<0.05);而山地組LPL基因表達量顯著高于草地組(p<0.05),推測原因可能與牧草類型和所處環(huán)境有關。相比草地牧草,山地牧草類型多樣且營養(yǎng)豐富,使得山地組絨山羊攝入較多的n-3 PUFA,研究表明飲食中高水平的n-3 PUFA會抑制SCD酶的表達活性[33]。相比草地,山地較為寒冷,楊莉[34]研究表明寒冷應激后阿勒泰羊和湖羊各組織中LPL的表達量均顯著得升高。Bahnamiri等[35]研究表明相對于飽和脂肪酸,高的SCD mRNA豐度能導致更多的不飽和脂肪酸的合成,主要使棕櫚酸和硬脂酸去飽和形成棕櫚油酸和油酸[36],這與本試驗結果一致。LPL基因在控制肌肉組織和脂肪組織之間的三酰基甘油分配中起關鍵作用[33]。

圖1 不同放牧條件下SCD和LPL基因的表達量

2.4 脂肪代謝基因與肌內脂肪和脂肪酸含量的相關性分析

由表5可知,SCD 和LPL基因的表達量均與肌內脂肪含量呈正相關,且LPL基因的表達量與肌內脂肪含量呈顯著正相關(p<0.05),相關系數為0.587。與Wang等[37]和Jeong等[38]的研究結果一致,說明SCD和LPL基因高表達有利于肌內脂肪沉積。SCD基因表達量與MUFA含量呈顯著正相關(p<0.05),與Wang等[37]研究結果一致,在不飽和脂肪酸合成中SCD基因起著重要的作用,可將SFA轉化為MUFA。LPL基因表達量與PUFA呈極顯著負相關(p<0.01),與SFA呈正相關,這與田佳[39]的研究結果一致。有研究表明高含量的PUFA能夠干擾生脂酶LPL基因的轉錄和破壞其mRNA的穩(wěn)定性,進而會抑制LPL基因的表達[40]。祝仁鑄[41]研究表明LPL酶活性的增加,會促使脂肪酸再生能力的增加,更有利于脂肪的沉積。通過相關性可以證實SCD和LPL基因對于羊肉的脂肪沉積和脂肪酸組成是重要的,并且這些基因的評估和使用可以用于改善羊肉的質量。

表5 脂肪代謝基因與肌內脂肪和脂肪酸含量的相關性分析

3 結論

山地組肌內脂肪含量顯著高于草地組(p<0.05)。在脂肪酸含量方面,山地組中多不飽和脂肪酸的含量顯著高于草地組,特別是α-亞麻酸、DHA和CLA(p<0.05),且山地組n-6/n-3 PUFA比值為3.34,說明山地組絨山羊的肌內脂肪含量分布合理,且山地羊肉具有較高的營養(yǎng)價值。

在調控脂肪代謝的基因中,草地組SCD基因的表達量顯著高于山地組(p<0.05);而山地組LPL基因的表達量顯著高于草地組(p<0.05);通過相關性分析可知,SCD基因的高表達能促進MUFA的沉積;LPL基因高表達能促進肌內脂肪的沉積,但卻會抑制肌肉中PUFA的沉積。因此,未來可通過調控SCD和LPL基因的表達來改善畜禽肉中脂肪和脂肪酸含量的沉積,從而提高羊肉的營養(yǎng)價值和品質。