余紫荊 譚明慧 包尚松 劉呈雄 鄧張雙 郭志勇 鄒 坤

(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

植物內(nèi)生菌種類繁多，具有復(fù)雜的多樣性，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分.植物和微生物在長達(dá)近億年的進(jìn)化過程中，形成穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系，為植物在應(yīng)對環(huán)境脅迫，病原菌的入侵等方面提供保護(hù)，被譽為植物的“第二套免疫系統(tǒng)”[1-3].植物內(nèi)生菌作為產(chǎn)生活性新穎的次級代謝產(chǎn)物的能力，廣泛的應(yīng)用于生物防治，外源基因載體及新藥來源等[4].杜英(Elaeocarpus decipiensHemsl)系杜英屬常綠植物，由于其病蟲害較少，生長快，而廣泛用于城市綠化.本文在從植物內(nèi)生菌中尋找活性次級代謝產(chǎn)物過程中，杜英葉片內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)提取物顯示強的抗菌活性，因而從中分離得到的一株內(nèi)生真菌Aspergillus versicolor，在實驗室中發(fā)酵，并分離鑒定其次級代謝產(chǎn)物，一共分離得到8個化合物，并測定了化合物1在固體發(fā)酵條件下的含量.

圖1 化合物1-8的結(jié)構(gòu)圖

1 實驗部分

1.1 儀器

微型臺式5415D型高速離心機(jī)(德國Eppendof公司)，SW-CJ-ZF型雙人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司)，DZ-900大容量振蕩器(太倉市實驗設(shè)備廠)，冰箱(中國Haier公司)，電子分析天平(中國上海梅特勒-托利多有限公司)，X-4數(shù)字顯示顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)，S-3100紫外可見分光光度計(SCINCO公司)，紫外線分析儀ZF-6型(上海精密實驗設(shè)備有限公司)，DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備有限公司)，N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)，圓二色譜儀(qCD，英國)，HPLC DIONEX Ultimate 3000(DAD美國戴安液相色譜有限公司)，HPLC Waters1525EF分析兼半制備(美國 Waters有限公司)，Ultrashied TM 400 MHz Plus核磁共振波譜儀(瑞士)，ISQ四級桿質(zhì)譜儀(賽洛菲有限公司)，Nicoler Auatar Speltrometer series FT360紅外光譜儀(美國)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Genios Tecan)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，Kromasil分析型色譜柱；(250×4.6 mm，5μm，250×4.6 mm，10μm)北京英萊克科技發(fā)展有限公司.

1.2 試劑

分析純葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠)，瓊脂粉(中國惠興生化試劑有限公司)，化學(xué)純薄層層析硅膠(200～300 mesh，硅膠H)青島海洋化工廠，RP-18硅膠填料(日本YMC公司)，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(美國安瑪西亞公司)，分析純氯仿，甲醇，丙酮，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，冰乙酸，次氯酸鈉醫(yī)用酒精(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠)，色譜純甲醇、乙腈(J.T.Baker.USA)，色譜純乙醇、正己烷(J.T.Baker.USA).

1.3 內(nèi)生真菌分離及鑒定菌株

從植物杜英葉片分離得到一株內(nèi)生真菌，并保存在4℃的PDA斜面培養(yǎng)基上，保存在三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究利用湖北省重點實驗室內(nèi)，經(jīng)18S RDNA-ITS分子生物學(xué)手段鑒定為Aspergillusversicolor.

1.4 內(nèi)生真菌培養(yǎng)及浸提

內(nèi)生真菌Aspergillusversicolor，先采用液體培養(yǎng)方法制取種子液，在500 m L三角瓶中裝200 m L馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，經(jīng)121℃高溫滅菌20 min，在超凈工作臺上從平板中接入真菌，接種5瓶，在室溫下?lián)u床培養(yǎng)7 d，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，作為種子液待用.然后把種子液接入3 000 m L三角瓶固體培養(yǎng)基(大米麩皮培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)40 d后，收集搗碎的固體培養(yǎng)基，用乙酸乙酯萃取，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得浸膏，把浸膏懸浮分散在500 m L蒸餾水中，分別以石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，分別得到石油醚，乙酸乙酯及正丁醇部位.

1.5 次級代謝產(chǎn)物分離

取乙酸乙酯部分浸膏20 g，用200～300目的硅膠干法拌樣，選用合適的正相硅膠柱，用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，經(jīng)TLC分析收集合并各組分，得到8個不同的片段.片段4經(jīng)正相硅膠柱層析，Sephadex LH-20層析及半制備HPLC，得到化合物1(2 g)，2(10 mg)，3(6 mg)和4(8 mg)，片段5通過正相硅膠柱層析，Sephadex LH-20層析及半制備HPLC分離得到化合物5(4 mg)，6(3 mg)，7(7 mg)，8(9 mg)，9(3 mg).

1.6 (8S)-hydroxysydonic acid(1)含量測定

采用HPLC對真菌發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯粗提物中主成分的含量進(jìn)行測定，以純化的主成分化合物為對照品.HPLC條件：以49%色譜甲醇/水(水中加入0.02%冰乙酸)為流動相，Kromasil分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm×10μm)，柱溫25℃，流速1 m L/min，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量10μL.

1)儀器精密度實驗.精密稱取20 mg對照品于EP管中，加入1 m L色譜甲醇溶解，超聲處理20 min，溶解為20 mg/m L，取該溶液50μL，加色譜甲醇至1 m L，稀釋至1 mg/m L，連續(xù)進(jìn)高效液相儀5次，統(tǒng)計對照品5次測量峰面積的RSD值，確認(rèn)儀器精密度是否良好.

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.依次吸取上述20 mg/m L照品溶液25μL、50μL、75μL、100μL、125μL于EP管中，再分別加入色譜甲醇至1 m L，超聲處理20 min，得主成分化合物對照品系列溶液.將上述系列對照品溶液依次注入液相色譜儀以檢測色譜峰的峰面積，然后將對照品的質(zhì)量濃度(mg/m L)設(shè)為橫坐標(biāo)(X)，其對應(yīng)的峰面積設(shè)為縱坐標(biāo)(Y)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程.

3)穩(wěn)定性試驗.精密稱取粗提物浸膏25 mg于EP管中，加入色譜甲醇1m L，超聲處理20 min，溶解為25 mg/m L.吸取該溶液200μL，加入色譜甲醇至1 m L，稀釋至5 mg/m L.然后將該5 mg/m L的溶液于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h重復(fù)進(jìn)樣.計算這5次測量的峰面積的RSD值，確認(rèn)樣品溶液在8 h內(nèi)是否穩(wěn)定.

4)重現(xiàn)性實驗.稱取粗提物浸膏5份，制備5份供試品溶液，制備方法同上.將5份供試品依次進(jìn)行HPLC測定.統(tǒng)計這5次測量的峰面積的RSD值，確認(rèn)該測定方法是否具有良好的重現(xiàn)性.

5)加樣回收試驗.依次吸取上述1 mg/m L對照品溶液800μL、900μL、1 000μL至EP管中，再分別加入色譜甲醇至1 m L，配制成0.8 mg/m L、0.9 mg/m L、1.0 mg/m L的對照品溶液.分別取對照品溶液各200μL至3個EP管中，再各自加入200μL已知主成分含量的8 mg/m L的粗提物供試品溶液.超聲處理20 min.將3份混合樣品依次進(jìn)行HPLC測定，計算加入的對照品的回收率.

6)計算8 mg/m L粗提物溶液中化合物1的含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為無色晶體，熔點135～136℃.紫外光譜顯示在248和304 nm處有吸收.其氫譜較為簡單，在芳香氫信號區(qū)域有3組信號分別位于δ7.28(d，8.2，1H)，7.46(dd，2.4，8.2，1 H)，7.39(d，2.4，1 H)處，通過耦合常數(shù)判斷該3組氫信號可能是1，3，4-三取代苯環(huán)特征峰信號.而高場區(qū)僅有δ1.96(m，1H)，1.80(m，1H)，1.40(m，2H)，1.39(m，1H)，1.28(m，1 H)的氫信號，此外還有3個甲基信號，分別位于δ1.60(s，3H)，1.11(s，3H)和1.10(s，3H)處.而化合物1的碳譜中顯示15個碳信號，其中烯碳信號7個，分別位于δ169.9，156.8，137.9，131.5，127.7，121.6，118.6，推測化合物1中可能含有1個與苯環(huán)共軛羧基存在；2個連氧季碳分別位于δ77.8和71.5處，3個CH2信號分別位于δ44.9，43.9，和19.9處，3個甲基信號位于δ28.8，29.1和29.2處.通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物1與(-)-hydroxysydonic acid的波譜數(shù)據(jù)一致[5].

化合物1的NMR數(shù)據(jù)：1H NMR(400 MHz，CD3OD-d4)：δ7.46(dd，2.4，8.2，1H)，7.39(d，2.4，1H)，7.28(d，8.2，1H)，1.96(m，1 H)，1.80(m，1H)，1.60(s，3H)，1.39(m，1H)，1.28(m，1H)，1.40(m，2H)，1.10(s，3 H)，1.11(s，3 H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD-d4)：δ169.9(C)，156.8(C)，137.9(C)，131.5(C)，127.7(CH)，121.6(CH)，118.6(CH)，77.8(C)，71.5(C)，44.9(CH2)，43.9(CH2)，29.2(CH3)，29.1(CH3)，28.8(CH3)，19.9(CH2).

化合物2為一無色油狀物，易溶于甲醇、丙酮.紫外光譜顯示在250和304 nm處有吸收.比較化合物2與化合物1的氫譜和碳譜發(fā)現(xiàn)，兩者之間在氫譜上的差別主要在于δ0.86(d，6.8，3H)的甲基氫信號，而在化合物1中該甲基信號為單峰，其次是明顯多了1個位于δ2.00(s，3 H)處的單峰甲基信號，根據(jù)其化學(xué)位移推斷該甲基可能為乙酰基上的甲基氫信號，最后在δ3.88(m，1H)，3.80(m，1H)處多出來2個連氧碳上的氫信號.進(jìn)一步分析其碳譜和DEPT譜發(fā)現(xiàn)，化合物2與化合物1相比，明顯多了1個δ173.1的碳信號，少了1個連氧季碳信號，多了1個位于δ70.5的CH2的碳信號.通過與文獻(xiàn)[6] 對比，因而確定化合物2為12-acetoxysydonic acid.

化合物2的NMR數(shù)據(jù)：1H NMR(400 MHz，CD3OD-d4)：δ7.44(d，8.0.1H)，7.38(br s，1H)，7.27(d，8.0，1 H)，3.88(m，1H)，3.80(m，1 H)，2.00(s，3H)，1.96(m，1H)，1.81(m，1H)，1.72(m，1H)1.60(s，3 H)，1.35(m，1 H)，1.29(m，2H)，1.11(m，1 H)，0.86(d，6.8，3 H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD-d4)：δ173.1(C)，169.9(C)，156.8(C)，137.6(C)，132.5(C)，127.7(CH)，121.5(CH)，118.6(CH)，77.7(C)，70.5(CH2)，43.4(CH2)，34.7(CH2)，33.7(CH)，28.8(CH3)，22.4(CH2)，20.8(CH3)，17.1(CH3).

化合物3為無色油狀物，易溶于甲醇、丙酮.紫外光譜顯示在249和301 nm處有吸收.化合物3的高分辨質(zhì)譜顯示其在m/e[M+Na]+=303.1202(Cacld.303.1203)，表明其分子式為C15H20O5，不飽和度為6，苯環(huán)和羧基共滿足5個不飽和度，說明化合物3中還有一個環(huán)存在.化合物3與化合物1相比，苯環(huán)上的部分氫和碳的波譜數(shù)據(jù)幾乎是一模一樣的，主要差別在于側(cè)鏈部分，化合物3中少了1個CH2，而多了1個連氧的CH；與化合物1相比，側(cè)鏈末端甲基明顯是相隔較開的2個單峰甲基信號，分別位于δ1.30(s，3H)，δ1.01(s，3H)處，推測化合物3中的側(cè)鏈還是通過醚鍵成環(huán)，只不過是在側(cè)鏈環(huán)上多了1個羥基而已.通過與文獻(xiàn)對比發(fā)現(xiàn)化合物3與(-)-(8S，11R)-11-hydroxysydowic acid的波譜數(shù)據(jù)一致[7]，因而確定化合物3為(-)-(8S，11R)-11-hydroxysydowic acid.

化合物3的NMR數(shù)據(jù)：1H NMR(400 MHz，CD3OD-d4)：δ7.26(d，8.1，1 H)，7.48(dd，1.5，8.1，1H)，7.38(d，1.5，1H)，2.23(m，2H)，2.00(m，1 H)，1.79(m，1 H)，3.43(m，1H)，1.30(s，3H)，1.01(s，3H)，1.52(s，3H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD-d4)：δ157.6(C)，137.8(C)，126.0(CH)，122.1(CH)，132.6(C)，119.2(CH)，170.1(C)，78.8(C)，29.7(CH2)，25.2(CH2)，71.6(CH)，78.8(C)，26.2(CH3)，26.1(CH3)，30.5(CH3).

化合物4為一無色油狀物，易溶于甲醇、丙酮.紫外光譜顯示在250和307 nm處有吸收.化合物4的高分辨質(zhì)譜顯示其在m/e[M+H]+=265.1440(Cacld.265.1440)，[M+Na]+=287.1259(Cacld.287.1259)，表明其分子式為C15H20O4，不飽和度為6，苯環(huán)和羧基滿足5個不飽和度，說明化合物4中還有一個環(huán)存在.化合物4與化合物(-)-hydroxysydonic acid(1)氫譜和碳譜非常相似.化合物4中3個甲基信號分別位于δ1.47(s，3 H)，1.28(s，3 H)和0.94(s，3H)處，而在化合物1中3個甲基分別位于δ1.60(s，3H)，1.11(s，3H)和1.10(s，3 H)；化合物4中的3個CH2分別位于δ2.51(m，1H)/1.68(m，1H)，1.72(m，2 H)和1.54(m，2H)處，而在化合物1中同樣的CH2位于δ1.96(m，1H)/1.80(m，1H)，1.39(m，1 H)/1.28(m，1 H)和1.40(m，2 H)處；同樣的其碳譜也是一樣，低場的碳信號很相似，但是高場的碳信號是不一樣的.

通過比較兩者的分子量發(fā)現(xiàn)化合物4比化合物1的分子量少18，顯然是少了1個水分子，因而推測，化合物4可能是化合物1分子內(nèi)縮水產(chǎn)物，因為側(cè)鏈上的2個羥基發(fā)生了分子內(nèi)的縮水而形成1個六元環(huán)的醚環(huán)結(jié)構(gòu)，因而其高場的氫信號發(fā)生較大的變化；通過ChemDraw簡單計算化合物4的最低能量構(gòu)象，表明化合物4中的苯環(huán)與六元醚環(huán)之間幾乎是垂直的，如下圖所示，恰好側(cè)鏈末端2個甲基通過醚鍵環(huán)合后，有一個甲基伸向苯環(huán)中間，而另一個甲基向外.

圖2 化合物4的最低能量構(gòu)象圖

根據(jù)核磁共振的環(huán)電流對基團(tuán)化學(xué)位移的影響，苯環(huán)外圍是去屏蔽區(qū)域，而靠近苯環(huán)中央是屏蔽區(qū)域，所以δ0.94的甲基信號位于苯環(huán)的屏蔽區(qū)域，δ1.28的甲基位于苯環(huán)去屏蔽區(qū)域，所以化合物4的甲基與化合物1的甲基化學(xué)位移相差比較大.通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物4與sydowic acid[8]的波譜學(xué)數(shù)據(jù)一致，因而確定化合物8為sydowic acid.

化合物4的NMR數(shù)據(jù)：1H NMR(400 MHz，CD3OD-d4)：δ7.48(dd，1.7，8.1，1 H)，7.37(d，1.7，1H)，7.23(d，8.1，1H)，2.51(m，1H)，1.72(m，2 H)，1.68(m，1 H)，1.54(m，2H)，1.47(s，3H)，1.28(s，3H)，0.94(s，3H)；13C NMR(100 MHz，CD3OD-d4)：δ169.8(C)，158.1(C)，137.5(C)，132.3(C)，126.1(CH)，122.0(CH)，119.1(C)，78.8(C)，76.2(C)，37.7(CH2)，34.8(CH2)，32.3(CH3)，31.7(CH3)，25.2(CH3)，17.7(CH2).

化合物5為無色油狀物，紫外光譜顯示在247和301 nm處有吸收.熔點158～159℃，EI-MS譜中的m/z：[M]+266.一維1H-NMR(CD3OD，400 MHz)中顯示10組峰，其中：δH7.45(dd，J=8.1，1.8 Hz，1H)，δH7.41(d，J=1.9 Hz，1H)，δH7.14(d，J=8.1 Hz，1H)為苯環(huán)上的3個氫信號；δH0.78(d，J=6.7 Hz，6 H)和δH1.59(s，3H)為3個甲基質(zhì)子信號；δH1.81(dddd，J=35.7，13.7，11.4，4.9 Hz，2H)，δH1.44(dq，J=13.2，6.7 Hz，1 H)，δH1.30(s，1H)，δH1.25(m，1H)，δH1.09(m，2H)5組多重峰為3個亞甲基質(zhì)子信號和1個叔氫信號.碳譜有明顯的6個苯環(huán)碳信號和1個苯環(huán)上羧基信號δ：118.54，121.33，127.14，131.28，136.85，156.43，169.8.根據(jù)一維核磁譜推測化合物5是化合物1的類似物.通過查閱文獻(xiàn)[9] 對比，發(fā)現(xiàn)化合物5與sydonic acid的波譜數(shù)據(jù)基本一致.1H-NMR(CD3OD，400 MHz)：δH7.45(dd，J=8.1，1.8 Hz，1H)，7.41(d，J=1.9 Hz，1H)，7.14(d，J=8.1 Hz，1 H)，1.81(dddd，J=13.7，11.4，Hz，2 H)，1.44(dq，J=13.2，6.7 Hz，1H)，1.30(s，1H)，1.25(m，1H)，1.09(m，2H)，0.78(d，J=6.7 Hz，6H)，1.59(s，3H)；13C-NMR(CD3OD，100 MHz)δ：22.37(C-10)，22.80(C-14)，22.86(C-13)，28.43(C-12)，28.60(C-15)，39.86(C-11)，43.48(C-9)，77.92(C-8)，118.54(C-6)，121.33(C-3)，127.14(C-4)，131.28(C-5)，136.85(C-2)，156.43(C-1)，169.8(C-7).

化合物6為無色油狀物，易溶于甲醇.其紫外光譜顯示其在250和310 nm處有吸收.EI-MS譜中m/z：[M]+264，比化合物5分子量少2.一維1H-NMR圖譜相比，化合物6在低場部分比化合物5少了一組甲基氫信號多了一組化學(xué)位移值較大的亞甲基氫信號：δH4.65(s，2 H)，推測化合物6在側(cè)鏈8號位或12號位有1個雙鍵，且碳譜的低場區(qū)有明顯的6個苯環(huán)碳信號和1個苯環(huán)上羧基信號和2個烯碳信號δ：113.13，120.10，122.36，123.59，125.64，138.93，139.70，157.51，167.44.兩組甲基氫信號化學(xué)位移較大，δH分別為：2.20(s，3H)，1.90(s，3H)，推斷雙鍵在12號位.13C-NMR(CD3OD-d4，100 MHz)δ：18.38(C-10)，22.35(C-13)，24.20(C-15)，40.02(C-11)，44.50(C-9)，79.02(C-8)，113.13(C-14)，120.10(C-6)，122.36(C-3)，123.59(C-4)，125.64(C-2)，138.93(C-5)，139.70(C-12)，157.51(C-1)，167.44(C-7).通過查閱文獻(xiàn)[6] ，發(fā)現(xiàn)化合物6與(S)-(+)-11-dehydrosydonic acid波譜數(shù)據(jù)一致.

化合物7為無色的油狀物，一維1H-NMR(CD3OD-d4，400 MHz)與化合物5對比，發(fā)現(xiàn)高場部分的氫信號基本相同，0.82(d，J=6.7 Hz，6H)，1.13(m，2 H)，1.29(m，2 H)，1.47(m，1 H)，1.57(s，3H)，1.92(m，2H)，表示與化合物5有相同的側(cè)鏈.4.58(s，2 H)是連有烯碳且連氧原子的氫信號，6.73(m，1H)，6.79(d，J=1.8 Hz，1H)，7.08(d，J=7.9 Hz，1 H)是苯環(huán)上的3個氫信號，結(jié)合13CNMR顯示的15個碳信號，推測化合物7比化合物5少了1個苯環(huán)共軛羧基.13C-NMR(CD3OD-d4，100 MHz)δ：22.92(C-13)，22.93(C-14)，22.92(C-10)，29.05(C-15)，29.11(C-12)，40.51(C-11)，44.14(C-9)，64.86(C-7)，78.11(C-8)，116.16(C-6)，118.76(C-4)，127.60(C-3)，131.27(C-2)，142.79(C-5)，157.06(C-1).通過查閱文獻(xiàn)[10] 對比發(fā)現(xiàn)化合物7與sydonol 1b的波譜數(shù)據(jù)基本一致.

化合物8為無色油狀物，一維1H-NMR(CD3OD-d4，400 MHz)中顯示出3個苯環(huán)氫質(zhì)子信號：δH7.46(d，J=7.5 Hz，2 H)，δH7.34(d，J=8.0 Hz，1H)；1個甲基氫質(zhì)子信號：δH1.78(s，3H)；δH2.68(m，2 H)，δH2.48(m，2 H)兩組多重峰為2個亞甲基質(zhì)子信號.13C-NMR(CD3OD-d4，100 MHz)共有12個碳信號δ：26.60(C-12)，29.71(C-9)，35.05(C-10)，88.71(C-8)，118.04(C-3)，121.58(C-6)，125.66(C-4)，133.12(C-5)，135.14(C-2)，154.49(C-1)，170.13(C-7)，179.62(C-11).通過查閱文獻(xiàn)[11] 對比發(fā)現(xiàn)化合物8與1-hydroxyboivinianic acid的波譜數(shù)據(jù)基本一致.

2.2 化合物1的含量測定

1)儀器精密度實驗.5次進(jìn)樣測定1 mg/m L標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積依次為：8546806，8469320，8469320，8697596，8369344.經(jīng)計算其RSD=1.5%，表明儀器精密度良好.

圖3 粗提物浸膏和化合物1的HPLC分析圖譜

2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.標(biāo)準(zhǔn)品濃度X與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰面積Y之間的回歸方程：Y=9×106X+244 055，r=0.999 3.化合物1質(zhì)量濃度在0.5～2.5 mg/m L內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

圖4 化合物1的含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3)穩(wěn)定性試驗.取5 mg/m L粗提物溶液在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h重復(fù)進(jìn)樣測量的峰面積分別為：5281021，5313669，5366448，5415220，5547225.RSD值為1.9%，確認(rèn)樣品溶液在8 h內(nèi)是基本穩(wěn)定的.

4)重復(fù)性實驗.取5份8 mg/m L的粗提物溶液分別進(jìn)樣，其吸收峰面積分別為：8330197，8581113，8385639，8470685，8576934.RSD值為1.3%，確認(rèn)此測定方法具有良好的重復(fù)性.

5)加樣回收試驗.取質(zhì)量濃度為8 mg/m L粗提物200μL，分3批加入200μL 0.8，0.9，1.0 mg/m L標(biāo)準(zhǔn)容易，分別進(jìn)樣檢測器峰面積，計算其回收率分別為102%，102.5及99%，平均回收率為101%，RSD值為1.9%，表明該測量方法的可信度較高.

6)化合物1的含量計算.8 mg/m L粗提物溶液的平均峰面積為8470685，代入上述回歸方程：Y=9×106X+244055，算得化合物1的濃度為0.91 mg/m L，因而算得化合物1在粗提物中的含量為11.4%.

3 結(jié) 論

從植物杜英葉片內(nèi)生真菌Aspergillusversicolor的固體培養(yǎng)基中分離得到8個次級代謝產(chǎn)物，經(jīng)核磁共振，質(zhì)譜等光譜學(xué)方法鑒定其結(jié)構(gòu)，分別為(-)-hydroxysydonic acid(1)，12-acetoxysydonic acid(2)，10-hydroxysydowic acid(3)，sydowic acid(4)，sydonic acid(5)，(S)-(+)-11-dehydrosydonic acid(6)，sydonol 1b(7)，(R)-hydroxyboivinianic acid(8).化合物1-8中，化合物1的量最大，通過HPLC測定了(-)-hydroxysydonic acid(1)的含量，在固體培養(yǎng)條件下其含量達(dá)11.4%.Sydonic acid衍生物實際上為倍半萜類化合物，是沒藥烷型倍半萜類結(jié)構(gòu)中唯一含苯環(huán)的天然產(chǎn)物.從2010年至今，此類化合物的結(jié)構(gòu)已經(jīng)從自然界中分離得到40余個，其結(jié)構(gòu)變化主要在羧基，酚羥基，側(cè)鏈上的羥基位置的變化及羥基與雙鍵的之間的轉(zhuǎn)化等的變化.文獻(xiàn)報道該此類沒藥烷型結(jié)構(gòu)主要是抗病毒，抗菌等活性[11-12].在這些化合物中化合物的含量達(dá)11.4%，在實驗室中純度達(dá)98%的化合物1的量已經(jīng)累計至8 g，為進(jìn)一步的開發(fā)以化合物1為母核結(jié)構(gòu)的活性先導(dǎo)化合物的應(yīng)用提供了物質(zhì)保障.