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        匍匐型地被菊再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

        2019-08-27 06:56:36趙靜雅徐素娟陳發(fā)棣滕年軍
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:潮霉素葉盤落英

        趙靜雅 徐素娟 陳發(fā)棣 滕年軍

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

        菊花(Chrysanthemum morifolium)為菊科菊屬多年生宿根草本花卉,起源于我國(guó),擁有悠久的栽培歷史,是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一,具有觀賞、食用以及藥用等多種價(jià)值[1]。 近年來,隨著植物基因工程的迅猛發(fā)展,轉(zhuǎn)基因分子育種已成為定向改變植物觀賞性狀,提高植物對(duì)脅迫的耐受性,延長(zhǎng)花期等的有效手段之一[2-3]。 同時(shí),農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是驗(yàn)證基因功能的重要方法之一[4-5]。 目前,大量研究者已建立了一些菊花品種的再生轉(zhuǎn)化方法,如寧云霞[1]建立了切花菊白安娜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系;徐式近等[6]利用葉片和莖段作為外植體,對(duì)9 種切花菊進(jìn)行再生誘導(dǎo);毛洪玉等[7]以葉片為外植體,獲得了中國(guó)紅轉(zhuǎn)基因植株。 但菊花的再生和遺傳轉(zhuǎn)化受到包括基因型、受體材料、抗生素、轉(zhuǎn)化條件等因素的影響[8-11];在再生和遺傳轉(zhuǎn)化過程中,玻璃化現(xiàn)象也是影響體系穩(wěn)定性、降低再生轉(zhuǎn)化效率的主要因素之一[12],因此不存在適合所有品種的再生及遺傳體系[13]。 而建立品種對(duì)應(yīng)的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系是導(dǎo)入外源基因,驗(yàn)證基因功能的前提[14],因此,建立有效的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。 此外,目前已得到的再生及轉(zhuǎn)化體系集中于切花菊及盆栽菊,而關(guān)于匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的研究并不常見。

        雨花落英是近年來培育出的匍匐型地被菊新品種,具有匍匐生長(zhǎng)、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、分枝性強(qiáng)、花朵繁多、自然花期晚、可粗放管理等特點(diǎn)[15]。 本研究以匍匐型地被菊雨花落英無菌苗幼嫩葉片為外植體,初步建立地被菊品種再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系,以期為進(jìn)一步研究基因功能及運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)雨花落英進(jìn)行品種改良奠定一定的理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        以適齡、健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的匍匐型地被菊雨花落英無菌苗葉片為試驗(yàn)材料,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花種質(zhì)資源保存中心提供;農(nóng)桿菌菌株EHA105 及植物表達(dá)干擾載體pMDC32-ami-CmERF12 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院菊花實(shí)驗(yàn)室保存。

        本試驗(yàn)采用的基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基,其中MS粉(HB8469-5)購自青島海博生物公司;蔗糖購自廣東西隴科學(xué)有限公司;瓊脂(A8190)、羧芐青霉素(Carbenicillin,Carb,C8250)、 潮 霉 素(Hygromycin,Hyg,H8080)、萘乙酸(Naphthalene-acetic acid,NAA,N8010)、6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA,A8170)、激動(dòng)素(6-KT,IK0060)均購自北京索萊寶生物公司。

        1.2 方法

        1.2.1 無菌苗的獲取 以地被菊品種雨花落英帶頂芽或幼嫩側(cè)芽的莖段為外植體,流水沖洗1 ~2 h 后,在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行以下操作:75%酒精消毒30 s,無菌水沖洗2~3 次,0.1% HgCl2溶液浸泡消毒5 min,無菌水沖洗3~4 次;隨后將莖段放置于濾紙上,無菌風(fēng)吹干莖段表面水分;最后將其切成0.5 ~1.0 cm 帶腋芽的小段,接種于普通MS 培養(yǎng)基上,培養(yǎng)約15 d 后,將長(zhǎng)成的無菌苗切成帶頂芽或腋芽的小段,接種于新的MS 培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng),此后每30 d 繼代培養(yǎng)1 次,以獲得后續(xù)試驗(yàn)所需組培苗。

        1.2.2 不同苗齡組培苗的葉盤再生 選取苗齡分別為25、30、40 d 的長(zhǎng)勢(shì)良好的組培苗,取頂端2~4 片幼葉,在超凈工作臺(tái)無菌環(huán)境下,去除葉脈,切成0.5 cm×0.5 cm 的葉盤,保證葉盤四邊均有切口,接種于再生培養(yǎng)基中。 每處理接種30 個(gè)外植體,接種于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,每處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。 培養(yǎng)皿為直徑90 mm 塑料培養(yǎng)皿,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件:光周期16 h 光照/8 h 黑暗,培養(yǎng)溫度為25℃(下同)。每隔15 d 繼代培養(yǎng)1 次,40 d 后統(tǒng)計(jì)葉盤不定芽再生情況,從而確定葉盤再生時(shí)所選擇的組培苗的最適苗齡。

        1.2.3 不同激素配比篩選 選取苗齡為30 d、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗,取頂端幼葉切成葉盤,接種于含不同濃度配比的6-BA 和NAA 的MS 再生培養(yǎng)基上。 預(yù)試驗(yàn)設(shè)置6-BA 濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1,NAA 濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1;根據(jù)預(yù)試驗(yàn)觀察到的試驗(yàn)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),進(jìn)一步細(xì)化6-BA 和NAA 的濃度和配比。 每個(gè)處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù)。 每15 d 繼代1 次,40 d 后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算葉片再生率和平均芽數(shù):

        1.3 遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

        選取苗齡為30 d、生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗,以已得到的最適再生培養(yǎng)基為基礎(chǔ),進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

        LAN Gang, WANG Xi-yong, GUO Da-wei, XIAO Huai-qing, XU Zhu-hui, ZHANG Zhi-hao

        1.3.1 潮霉素濃度的篩選 為確定潮霉素濃度,避免其對(duì)葉盤再生分化的抑制,將正常葉盤分別接種于分別含有0、5、8、10、12、15 mg·L-1潮霉素的再生培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1,下同)上,每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),培養(yǎng)20 d 后觀察葉盤生長(zhǎng)狀況和再生情況,確定適宜的潮霉素濃度;為確定潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗的臨界值,將雨花落英組培苗分別繼代培養(yǎng)至含有0、5、8、10、12、15 mg·L-1潮霉素的MS 培養(yǎng)基上,每處理接種20 個(gè)外植體于8 ~9 個(gè)組培瓶中,設(shè)3 次重復(fù),20 d 后觀察其生根情況,從而確定轉(zhuǎn)基因苗的潮霉素生根篩選濃度。

        1.3.2 羧芐青霉素濃度的篩選 將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的雨花落英葉盤分別接種于添加0、100、200、300、400 mg·L-1羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基上,每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),培養(yǎng)5 d 后,觀察其對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用;用無菌水沖洗掉葉盤表面農(nóng)桿菌,放置于新的培養(yǎng)基上,統(tǒng)計(jì)葉盤存活率。

        1.3.3 遺傳轉(zhuǎn)化條件的篩選 1)培養(yǎng)時(shí)間的確定:將葉盤置于再生培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),預(yù)培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為0、1、2、3 d,其他培養(yǎng)條件相同。 每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)情況,統(tǒng)計(jì)延遲培養(yǎng)后的葉盤存活率以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的抗性芽再生率,從而確定最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間;

        2)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間確定:將葉盤在再生培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d 后,采用農(nóng)桿菌侵染液進(jìn)行侵染,侵染時(shí)間分別設(shè)置為3、5、7、10、15 min,其他培養(yǎng)條件相同。 每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)情況,統(tǒng)計(jì)葉盤存活率以及抗性芽再生率,從而確定最適合的農(nóng)桿菌侵染時(shí)間;

        3)共培養(yǎng)時(shí)間的確定:由于農(nóng)桿菌只有在黑暗條件下才能將其所攜帶的質(zhì)粒整合到植物的基因組中,因此需要將葉盤與農(nóng)桿菌進(jìn)行一定時(shí)間的共同暗培養(yǎng)。 將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的葉盤接種于新的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。 共培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、5、7 d,其他培養(yǎng)條件相同。 每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)狀況,統(tǒng)計(jì)葉盤存活率以及抗性芽再生率,從而確定最適合的共培養(yǎng)(暗)時(shí)間;

        4)延遲培養(yǎng)時(shí)間的確定:經(jīng)過2 d 的共培養(yǎng)后,將葉盤轉(zhuǎn)入含有羧芐青霉素的延遲培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1+Carb 400 mg·L-1)上進(jìn)行脫菌培養(yǎng),延遲培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為0、3、5、7、9 d,隨后轉(zhuǎn)入含有一定濃度的羧芐青霉素和潮霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)狀況,統(tǒng)計(jì)抗性芽再生率,從而確定最適合的延遲培養(yǎng)時(shí)間;

        5)6-KT 培養(yǎng)濃度確定:葉盤經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)及延遲培養(yǎng)后,置于含有在一定濃度的羧芐青霉素和潮霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),每15 d 繼代1 次,根據(jù)篩選出的潮霉素選擇壓逐步降低潮霉素濃度培養(yǎng)45 d 后,向培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-KT,觀察其對(duì)不定芽再生的影響。 6-KT 濃度分別設(shè)置為0、0.25、0.5 mg·L-1,每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)狀況,統(tǒng)計(jì)抗性芽再生率,從而確定最適合的6-KT 培養(yǎng)濃度。

        1.4 玻璃化苗的恢復(fù)

        在遺傳轉(zhuǎn)化過程中,雨花落英葉盤及再生芽不可避免地出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。 調(diào)整篩選培養(yǎng)基中蔗糖及6-BA 濃度,蔗糖濃度分別設(shè)置為30、40、50 g·L-1,6-BA 濃度分別設(shè)置為2.0、1.5、1.0 mg·L-1,觀察玻璃化苗的恢復(fù)情況。

        1.5 轉(zhuǎn)基因菊花的檢測(cè)

        1.5.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè) 將得到的抗性芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中,2 周后觀察其生根情況。 對(duì)在生根培養(yǎng)基上成功生根的抗性苗提取DNA,分別使用2對(duì)引物(Hyg-F、Hyg-R 和35S、Ⅱ)檢測(cè)其是否為轉(zhuǎn)基因陽性苗。 其中,第1 對(duì)引物根據(jù)pMDC32 載體上的潮霉素抗性序列設(shè)計(jì);第二對(duì)引物以pMDC32 載體上的CaMV35S 啟動(dòng)子序列為模板設(shè)計(jì)前引物,以基因特異引物Ⅱ?yàn)楹笠铩?/p>

        1.5.2 RT-qPCR 驗(yàn)證基因的相對(duì)表達(dá)量 對(duì)普通PCR 檢測(cè)確定的陽性苗進(jìn)行擴(kuò)繁繼代15 d 后,取長(zhǎng)勢(shì)相同的組培苗相同葉位的葉片,提取植物總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以菊花EF1α(登錄號(hào):KF305681)基因作為內(nèi)參對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性苗中的CmERF12 基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量驗(yàn)證。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 組培苗最適苗齡及不同激素配比對(duì)葉盤再生的影響

        由表1可知,在相同苗齡期,當(dāng)6-BA 濃度一定時(shí),除苗齡為40 d 外,不定芽的再生率均隨著NAA 濃度的提高而呈上升趨勢(shì)。 當(dāng)6-BA 濃度達(dá)到3.0 mg·L-1時(shí),不同苗齡期的葉盤再生率均最低,有的苗齡期不定芽的分化率甚至為0;苗齡為30 d 時(shí)的組培苗與其他苗齡期相比,在不同激素濃度分配下葉盤再生率均最高。 苗齡為40 d 時(shí)的組培苗的葉盤再生效果最差,再生率最高僅64.76%,此時(shí)培養(yǎng)基中,6-BA 濃度為2.0 mg·L-1,NAA 濃度為1.0 mg·L-1。 苗齡為25 d 時(shí)的組培苗葉盤在6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1和6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 為1.0 mg·L-1條件下,再生率分別為80.37%和71.22%,二者間差異不顯著但顯著高于其他處理。 試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)苗齡為25 d 的組培苗葉片再生出的不定芽存在不同程度的玻璃化現(xiàn)象,不利于遺傳轉(zhuǎn)化。 苗齡30 d 的組培苗,葉盤再生率最高的激素組合為6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1,再生率為76.25%,但不同的重復(fù)之間存在著較大的差異;其次是6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1,再生率為72.78%,二者間差異不顯著。 綜上,初步篩選出組培苗最適苗齡為30 d,最適激素配比為6-BA 1.0 ~2.0 mg·L-1,NAA 0.5~1.0 mg·L-1,由于篩選出的最高葉盤再生率低于80%,因此在苗齡30 d 的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)激素濃度配比進(jìn)行篩選。

        在初篩預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以30 d 苗齡的無菌苗葉片為外植體,進(jìn)一步細(xì)化6-BA 和NAA 的濃度和配比最終將6-BA 濃度分別設(shè)為1.0、1.5、2.0 mg·L-1,NAA 濃度分別設(shè)為0.5、0.6、1.0 mg·L-1。 結(jié)果表明,在當(dāng)前處理濃度下,愈傷膨大疏松,均有不定芽發(fā)生。其中,6-BA 濃度為1.5 mg·L-1,NAA 濃度為0.8 mg·L-1時(shí),葉盤顏色鮮綠,再生率最高,達(dá)91.11%;培養(yǎng)2~3 周后有綠色芽點(diǎn)發(fā)生,且不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好,整齊一致,平均芽數(shù)高達(dá)5.90,適合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(圖1-E,表2)。 當(dāng)6-BA 濃度為2.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.5 mg·L-1及6-BA 濃度為2.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.5 mg·L-1時(shí),葉盤再生率和平均芽數(shù)均為最低,愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好,但不定芽發(fā)生較少(圖1-D、G,表2)。 綜上,確定葉盤分化培養(yǎng)基最佳配比為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1。

        表1 不同苗齡及激素配比對(duì)雨花落英葉盤再生的影響Table1 Effects of seedling age and plant hormone on regeneration of Yuhualuoying

        表2 不同激素配比對(duì)雨花落英葉盤再生的影響Table2 Effects of plant hormone ratio on regeneration of Yuhualuoying

        2.2 潮霉素濃度的確定

        由圖2、圖3可知,雨花落英葉盤對(duì)潮霉素較為敏感,當(dāng)再生培養(yǎng)基中未添加潮霉素時(shí),愈傷組織膨大,呈鮮綠色,不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好(圖3-A);隨著潮霉素濃度的增加,葉盤組織的褐死率逐漸升高,且不定芽的再生率逐漸降低。 潮霉素濃度為5 mg·L-1時(shí),組織存活率較高,約為72.69%,葉盤邊緣組織褐化,不定芽的再生開始受到抑制,部分葉盤壞死且無不定芽的產(chǎn)生,但仍具55.81%的再生率(圖3-B);當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到8 mg·L-1時(shí),葉盤褐化,呈焦炭狀,50%以上的組織死亡,不定芽的再生受到嚴(yán)重抑制,僅有17.93%的再生率,芽點(diǎn)黃化,生長(zhǎng)異常(圖3-C);當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí),葉盤失水,生長(zhǎng)異常,組織褐死率高達(dá)84.97%,僅有6.82%的不定芽再生(圖3-D);當(dāng)潮霉素濃度高于12 mg·L-1時(shí),葉盤壞死,停止生長(zhǎng),不定芽的再生完全被抑制,無不定芽的產(chǎn)生(圖3-D、F)。 因此潮霉素抑制不定芽再生分化的臨界值為12 mg·L-1。為保證葉盤能夠在含有潮霉素的培養(yǎng)基上分化,其篩選濃度應(yīng)低于致死的臨界值,因此在遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中,設(shè)置潮霉素葉盤篩選的選擇壓為8 ~10 mg·L-1,且在培養(yǎng)過程中逐漸降低潮霉素濃度,降低潮霉素對(duì)葉盤的抑制作用。

        圖1 不同激素配比下雨花落英葉盤再生情況Fig.1 Regeneration of Yuhualuoying in different plant hormone ratios

        圖3 不同潮霉素濃度下的葉盤狀態(tài)Fig.3 State of leaf disk under different Hygromycin concentrations

        圖4 潮霉素濃度對(duì)雨花落英生根的影響Fig.4 Effects of Hygromycin concentration on regeneration of Yuhualuoying

        由圖4可知,根系對(duì)潮霉素的反應(yīng)較敏感,潮霉素對(duì)雨花落英根系生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。 當(dāng)培養(yǎng)基中無潮霉素添加時(shí),根系及葉片生長(zhǎng)正常,根多且健壯(圖5-A)。 隨著潮霉素濃度的增加,雨花落英生根率逐漸降低,這與葉盤的反應(yīng)一致。 在加入潮霉素的培養(yǎng)基中,雖然有根系的生成,與正常培養(yǎng)基中的根系相比較低且根較柔弱(圖5-B),或呈現(xiàn)出明顯的木質(zhì)化,根系生長(zhǎng)到一定階段時(shí)受到抑制,當(dāng)潮霉素濃度為8~10 mg·L-1時(shí),植株部分葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象(圖5-C、D);當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到12 mg·L-1以上時(shí),表現(xiàn)為植株弱小,植株停止生長(zhǎng),葉片白化,整株死亡(圖5-E、F)。綜上,潮霉素生根篩選濃度為11 mg·L-1。

        2.3 羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制情況

        圖5 不同潮霉素濃度下的根系生長(zhǎng)狀況Fig.5 Root state under different Hygromycin concentrations

        由表3可知,在添加了不同濃度羧芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后,農(nóng)桿菌的抑制狀況和葉盤的生長(zhǎng)狀態(tài)完全不同。 在不添加羧芐青霉素的培養(yǎng)基上,農(nóng)桿菌大量生長(zhǎng),布滿培養(yǎng)皿和所有葉盤表面,葉盤變軟褐化死亡;羧芐青霉素濃度為100 mg·L-1時(shí),仍有較多菌落出現(xiàn),經(jīng)過無菌水沖洗,只有極少葉盤存活,但存活的葉盤變軟,表面有褐狀斑塊,且無法繼續(xù)生長(zhǎng)形成愈傷;當(dāng)羧芐青霉素濃度逐漸升高,培養(yǎng)皿及葉盤周圍的農(nóng)桿菌菌落逐漸減少;當(dāng)羧芐青霉素濃度達(dá)到300 mg·L-1時(shí),只有很少的農(nóng)桿菌菌落散布于部分葉盤周圍,且葉盤能夠正常生長(zhǎng)和脫分化形成愈傷組織,組織嫩綠、健康、致密,長(zhǎng)勢(shì)良好,葉盤存活率為65.56%,與其他處理差異顯著;當(dāng)羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1時(shí),農(nóng)桿菌被完全抑制,且愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好,葉盤存活率最高為100%,顯著高于其他處理。 綜上,設(shè)置延遲培養(yǎng)基中,羧芐青霉素篩選濃度為400 mg·L-1。

        表3 羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果及葉盤生長(zhǎng)情況Table3 Effects of Carb on agrobacterium inhibition and explant growth

        2.4 轉(zhuǎn)化條件的確定

        2.4.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖6可知,預(yù)培養(yǎng)可以明顯降低農(nóng)桿菌對(duì)葉盤的傷害。 未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉盤在侵染后,即使使用了羧芐青霉素抑制農(nóng)桿菌,仍存在農(nóng)桿菌爆發(fā)現(xiàn)象,所有葉盤均被農(nóng)桿菌污染,存活率為0;預(yù)培養(yǎng)2 d 的葉盤存活率高達(dá)90%以上,且抗性芽再生率最高,為13.57%;預(yù)培養(yǎng)3 d 的葉盤存活率達(dá)到100%,預(yù)培養(yǎng)2 d 和3 d 的葉盤存活率顯著高于其他處理,但預(yù)培養(yǎng)3 d 的再生得到的抗性芽數(shù)較少,僅有7.06%的再生率,多數(shù)葉盤在培養(yǎng)后期褐化死亡。 綜上,預(yù)培養(yǎng)最適時(shí)間為2 d。

        圖6 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effects of pre-culture time on genetic transformation

        2.4.2 侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖7可知,侵染時(shí)間對(duì)葉盤遺傳轉(zhuǎn)化有顯著影響,隨著侵染時(shí)間增加,葉盤存活率逐漸降低,當(dāng)侵染時(shí)間低于3 min 時(shí),無法產(chǎn)生抗性愈傷和抗性芽點(diǎn),當(dāng)侵染時(shí)間為7 min時(shí),抗性芽再生率最高;當(dāng)浸染時(shí)間高于7 min 時(shí)農(nóng)桿菌對(duì)葉盤的傷害明顯,葉盤存活率和抗生素再生率均顯著降低;侵染時(shí)間為15 min 時(shí),無葉盤存活和抗性芽再生。 綜上,侵染時(shí)間設(shè)置為5 ~7 min 最適宜。 抗性芽再生率在侵染時(shí)間為5 min 和7 min 時(shí)無顯著性差異,而侵染時(shí)間為5 min 時(shí),葉盤存活率為96.67%,顯著高于7 min 時(shí)的葉盤存活率,因此確定最佳的侵染時(shí)間為5 min。

        圖7 侵染時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effects of infection time on genetic transformation

        2.4.3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖8可知,隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加,葉盤存活率逐漸降低,而抗性芽再生率呈先上升后降低的趨勢(shì),這與葉盤外植體對(duì)侵染時(shí)間的反應(yīng)相似。 共培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí),抗性芽再生率較低,為3.45%;共培養(yǎng)時(shí)間為2 d 時(shí),抗性芽再生率雖與3 d 時(shí)無顯著差異,但共培養(yǎng)2 d 時(shí)的葉盤存活率顯著高于共培養(yǎng)3 d 時(shí)的葉盤存活率。 因此,選擇最佳的共培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

        圖8 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.8 Effects of co-culture time on genetic transformation

        2.4.4 延遲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖9可知,未經(jīng)延遲培養(yǎng)的葉盤無抗性芽生成,表明一定時(shí)間的延遲培養(yǎng)是必須的;隨著延遲培養(yǎng)時(shí)間的增加,抗性芽再生率呈先增加后降低的趨勢(shì),延遲培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí),抗性芽再生率最高,且顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間;當(dāng)延遲培養(yǎng)時(shí)間大于5 d 時(shí),愈傷組織變硬,呈焦炭狀,部分變褐,無分化能力。 綜上,延遲培養(yǎng)最適時(shí)間為5 d。 此時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)良好,且抗性芽再生能力較強(qiáng)。

        圖9 延遲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.9 Effects of postponed culture time on genetic transformation

        2.4.5 6-KT 對(duì)葉盤遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖10 可知,在不添加6-KT 的篩選培養(yǎng)基中,抗性芽再生率較低,為2.22%;6-KT 濃度為0.25 mg·L-1時(shí),抗性芽再生率達(dá)到15.71%,顯著高于不加6-KT 處理;6-KT 濃度為0.5 mg·L-1時(shí),抗性芽再生率又降至7.85%,仍高于不加6-KT 處理,但差異不顯著。 綜上,添加0.25 mg·L-1的6-KT 能夠顯著提高抗性芽的再生率。

        2.5 玻璃化再生苗的恢復(fù)

        圖10 6-KT 對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化再生的影響Fig.10 Effects of 6-KT on genetic transformation

        經(jīng)過對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化過程中各個(gè)條件的優(yōu)化,獲得了15.71%的不定芽再生率,但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)葉盤上再生出的抗性芽均有不同程度的玻璃化現(xiàn)象。 由表4可知,調(diào)整6-BA 和蔗糖濃度能夠使玻璃化的菊花苗恢復(fù)正常。 當(dāng)蔗糖濃度固定不變時(shí),隨著6-BA 濃度的增加,玻璃化苗的恢復(fù)率逐漸降低,且有顯著性差異。當(dāng)6-BA 濃度不變時(shí),蔗糖濃度增加整體上玻璃化苗的恢復(fù)率逐漸增加,但當(dāng)蔗糖濃度高于40 g·L-1時(shí),對(duì)玻璃化苗的恢復(fù)率無明顯提高。 因此,使玻璃化苗恢復(fù)的最適培養(yǎng)基中,應(yīng)加入的6-BA 濃度為1.0 mg·L-1、蔗糖濃度為40 g·L-1,此時(shí)玻璃化苗的恢復(fù)率為100%。 此外,本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用普通組培瓶蓋為封口材料時(shí),由于透氣性差,瓶?jī)?nèi)相對(duì)濕度較大,不利于玻璃化苗的恢復(fù);當(dāng)使用封口膜為封口材料時(shí),由于透氣性太強(qiáng),培養(yǎng)基很快失水萎縮,不利于組培苗的生長(zhǎng),因此選用帶有透氣口的組培瓶蓋為封口材料總體效果最佳。

        表4 不同蔗糖和6-BA 濃度對(duì)玻璃化苗恢復(fù)的影響Table4 Effects of different concentrations of sucrose and 6-BA on vitrification recovery

        2.6 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與分子鑒定

        2.6.1 雨花落英轉(zhuǎn)基因株系的獲得 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化地被菊雨花落英:取苗齡為30 d 的組培苗頂端幼嫩葉片,切成0.5 cm×0.5 cm 的葉盤,接種于再生培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2 d(圖11-A)。 將葉盤置于農(nóng)桿菌侵染液中侵染5 min,取出后用無菌濾紙吸干侵染液,并將葉盤置于新的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d,轉(zhuǎn)入添加400 mg·L-1的羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基上延遲培養(yǎng)5 d,之后轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1+Hyg 10 mg·L-1)培養(yǎng)。 由于葉盤在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被吸收而逐漸減少,因此每15 d 繼代至新的培養(yǎng)基上,同時(shí)將NAA 濃度逐漸降低,以模擬在理想培養(yǎng)狀態(tài)下葉盤所處的激素環(huán)境(6-BA 與NAA 比例逐漸升高)。 在此過程中,葉盤不斷生長(zhǎng)、膨大,產(chǎn)生抗性愈傷組織(圖11-B)。 繼代3 次后,將葉盤轉(zhuǎn)入到添加0.25 mg·L-16-KT 的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至有抗性芽點(diǎn)發(fā)生,抗性不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,部分愈傷無法分化,逐漸黃化或褐化(圖11-C)。 調(diào)整培養(yǎng)基中6-BA 的濃度為1.0 mg·L-1,蔗糖濃度為40 g·L-1,使玻璃化苗恢復(fù)正常(圖11-D)。 將小苗切成單株,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+Hyg 11 mg·L-1)中進(jìn)行篩選,去除白化、黃化以及不能正常生長(zhǎng)生根的植株,其余植株能夠正常生根,根系及葉片生長(zhǎng)正常,根多且健壯的被認(rèn)為是抗性植株(圖11-E、F)。 最終獲得抗性生根植株約60 株。

        2.6.2 轉(zhuǎn)基因植株在基因組水平上的PCR 檢測(cè) 對(duì)生根篩選得到的部分抗性苗進(jìn)行DNA 水平的鑒定。以清水為模板作為對(duì)照以排除操作失誤的可能性(CK1),以雨花落英野生型(WT)的DNA 為模板作為陰性對(duì)照(CK2),以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照(CK3)。 由圖12 可知,在被鑒定的15 株抗性苗中,有10 株(株系1、3、5、6、7、8、10、11、12、14)用2 對(duì)引物的PCR 檢測(cè)均擴(kuò)增出大小正確的目的條帶,與陽性對(duì)照大小一致。其余未擴(kuò)增出目的條帶,或者只有1 對(duì)引物擴(kuò)增出了條帶。 清水對(duì)照和WT 均未擴(kuò)增出目的條帶,說明試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。 這10 株抗性苗被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因陽性苗,其他的抗性苗為假陽性,假陽性概率為33.3%。2.6.3 RT-qPCR 驗(yàn)證基因的相對(duì)表達(dá)量 以菊花EF12 基因?yàn)閮?nèi)參基因,對(duì)經(jīng)過DNA 水平驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因陽性苗進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量,用同批的WT 作為對(duì)照。 定量驗(yàn)證結(jié)果表明,在10 株陽性苗中,9 個(gè)株系的CmERF12 基因均受到了明顯的抑制表達(dá),其中株系3、株系6、株系7 和株系12 的相對(duì)表達(dá)量最低,分別是WT 的0.48 倍、0.48 倍、0.45 倍和0.45 倍,株系1 和株系14 分別是WT 的0.53 倍和0.52 倍;株系5、株系8 和株系10 分別是WT 的0.58倍、0.61 倍和0.61 倍。 株系11 的表達(dá)量變化最小,為WT 的0.91 倍(圖13)。

        圖11 轉(zhuǎn)基因抗性植株過程Fig.11 Regeneration process of transgenic resistant plants

        3 討論

        近年來,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在菊花轉(zhuǎn)基因研究中得到廣泛運(yùn)用,為菊花性狀改良提供了新思路[16]。 菊花的離體再生受多種因素的影響,如吳友根[17]研究表明,當(dāng)以葉片為外植體進(jìn)行植株再生時(shí),幼嫩葉片比成熟葉片有更高的再生效率。 本研究中,當(dāng)組培苗苗齡為30 d 時(shí),其葉片再生率明顯高于苗齡為25 d 和40 d 的組培苗葉片,與前人研究存在差異。繼代培養(yǎng)40 d 后的組培苗在各種再生培養(yǎng)基上的再生頻率均低于65%,其原因可能是組培苗苗齡較大,葉片組織脫分化和再分化能力較弱,再生為新植株的能力相對(duì)較弱[18]。 而苗齡為25 d 的組培苗葉片,雖然在部分培養(yǎng)基上再生率高于80%,但是在培養(yǎng)后期,再生芽出現(xiàn)不同程度的玻璃化,因此不適合作為雨花落英再生條件,可能是由于苗齡較小,植株含水量較高,造成玻璃化現(xiàn)象[7]。 Naing 等[10]研究表明,葉盤進(jìn)行芽的分化還受培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度及配比的影響。 本研究中,最適的再生培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1。 同為匍匐型地被菊,本研究中雨花落英最適再生培養(yǎng)基與崔新利等[18]篩選出的雨花勛章的最適培養(yǎng)基配方不同,這可能是由于不同的基因型和品種對(duì)于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素的敏感性不同,表明不同植物類型、不同品種,甚至不同的生長(zhǎng)狀態(tài)下,再生體系不能通用,需要進(jìn)一步篩選。

        圖12 部分轉(zhuǎn)基因抗性苗DNA 水平鑒定結(jié)果Fig.12 Identification of partial transgenic seedlings at DNA level

        圖13 轉(zhuǎn)基因陽性苗定量驗(yàn)證Fig.13 Relative expression level of the positive transgenic seedlings

        農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法是一種常用的獲得轉(zhuǎn)基因苗、研究基因功能的基因工程手段[14]。 轉(zhuǎn)化效率受侵染液濃度、侵染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等諸多因素的影響[19]。 本研究在獲得匍匐型地被菊雨花落英最適再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的各個(gè)因素做進(jìn)一步研究,獲得了最優(yōu)的遺傳轉(zhuǎn)化組合。 轉(zhuǎn)化過程中,常用的抗生素有兩類,一類用于抑制農(nóng)桿菌的爆發(fā),如羧芐青霉素、頭孢噻肟、特美汀等[20-21];另一類用于初步篩選轉(zhuǎn)基因的抗性植株,如卡那霉素和潮霉素[22-23]。 本研究分別采用羧芐青霉素和潮霉素作為抑菌和篩選抗生素,按照優(yōu)化的體系,得到了轉(zhuǎn)基因抗性植株,但僅有2.22%的轉(zhuǎn)化率。 6-KT 是一種細(xì)胞分裂素類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,可以與其他激素共同作用于植物外植體的分化與再生[24]。 本研究發(fā)現(xiàn)加入0.25 mg·L-16-KT 的培養(yǎng)基可以獲得更高的抗性芽再生率(15.71%),這可能是由于6-KT 可以與6-BA 起到協(xié)同作用,促進(jìn)愈傷組織塊細(xì)胞分裂和芽的分化,與房順達(dá)等[25]在梅花離體培養(yǎng)研究中得到的結(jié)論一致。 但6-KT 是在葉盤培養(yǎng)后期加入到篩選培養(yǎng)基中的,在培養(yǎng)初期加入一定量的6-KT 是否能更有效地提高遺傳轉(zhuǎn)化效率還需要進(jìn)一步研究。

        玻璃化現(xiàn)象是組織培養(yǎng)過程中,組培苗普遍存在的一種水漬狀、半透明的病態(tài)生理現(xiàn)象[12]。 1981年,Debergh 等[26]通過研究菊科植物扶郎和洋薊首次提出玻璃化現(xiàn)象。 玻璃化苗恢復(fù)正常的難度較大,嚴(yán)重影響再生和轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性,前人研究中一旦出現(xiàn)玻璃化問題,試驗(yàn)就會(huì)被認(rèn)定為失敗,玻璃化苗也會(huì)被放棄[27]。 呂亞鳳等[28]研究發(fā)現(xiàn),玻璃化率隨著6-BA 濃度的升高而增加,而李瓊潔等[29]則認(rèn)為,6-BA 濃度過高或過低,均不利于玻璃化苗的恢復(fù)。 也有研究表明,提高蔗糖濃度可以有效防止玻璃化的發(fā)生[30]。 在本研究中,較高濃度的6-BA 是抗性芽發(fā)生的必要條件,而在此條件下,玻璃化的現(xiàn)象無法避免,此外本試驗(yàn)通過提高蔗糖濃度,降低6-BA 濃度,將玻璃化苗成功轉(zhuǎn)化為正常苗,從而節(jié)約了時(shí)間成本。 但關(guān)于如何避免玻璃化苗的形成還需進(jìn)一步研究。

        在得到轉(zhuǎn)基因抗性植株后,采用PCR 和RT-qPCR進(jìn)行分子鑒定,是基因工程的必要過程[31]。 本研究通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)外源基因已成功轉(zhuǎn)入雨花落英植株中,并能夠在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因的表達(dá),表明通過建立的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系可以成功獲得雨花落英轉(zhuǎn)基因植株。

        4 結(jié)論

        本研究結(jié)果表明,以苗齡為30 d 的組培苗幼嫩葉片為外植體,以MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1為再生培養(yǎng)基,是一種較為理想的誘導(dǎo)地被菊雨花落英葉盤再生的方法,此時(shí)葉盤再生率最高,達(dá)91.11%,平均芽數(shù)高達(dá)5.90。 在此基礎(chǔ)上,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行葉盤外植體遺傳轉(zhuǎn)化,預(yù)培養(yǎng)2 d,侵染5 min,共培養(yǎng)2 d,延遲培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行選擇培養(yǎng),可以得到轉(zhuǎn)基因抗性植株。 400 mg·L-1羧芐青霉素能夠在不影響葉盤分生生長(zhǎng)的情況下有效抑制農(nóng)桿菌的爆發(fā);潮霉素能夠?qū)﹃栃悦邕M(jìn)行篩選,顯著降低轉(zhuǎn)基因苗的假陽性,假陽性概率僅為33.3%;培養(yǎng)后期加入0.25 mg·L-16-KT 可以有效提高抗性芽的再生率,但是否可以在培養(yǎng)初期加入一定量的6-KT,以提高遺傳轉(zhuǎn)化效率仍需進(jìn)一步研究;調(diào)節(jié)6-BA 濃度為1.0 mg·L-1,蔗糖濃度為40 g·L-1,可以將得到的玻璃化苗轉(zhuǎn)化為正常苗,這在一定程度上避免了玻璃化苗被遺棄造成的資源浪費(fèi)的現(xiàn)象;然而針對(duì)如何通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來避免玻璃化苗的產(chǎn)生,提高遺傳轉(zhuǎn)化效率,仍需進(jìn)一步研究。 本研究通過雨花落英葉盤的再生和遺傳轉(zhuǎn)化,得到了轉(zhuǎn)基因抑制株系,為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因植株表型,驗(yàn)證基因功能提供了原材料,同時(shí)為通過外源基因遺傳轉(zhuǎn)化改良地被菊性狀奠定了一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

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