趙靜雅 徐素娟 陳發(fā)棣 滕年軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemum morifolium)為菊科菊屬多年生宿根草本花卉,起源于我國(guó),擁有悠久的栽培歷史,是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一,具有觀賞、食用以及藥用等多種價(jià)值[1]。 近年來,隨著植物基因工程的迅猛發(fā)展,轉(zhuǎn)基因分子育種已成為定向改變植物觀賞性狀,提高植物對(duì)脅迫的耐受性,延長(zhǎng)花期等的有效手段之一[2-3]。 同時(shí),農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是驗(yàn)證基因功能的重要方法之一[4-5]。 目前,大量研究者已建立了一些菊花品種的再生轉(zhuǎn)化方法,如寧云霞[1]建立了切花菊白安娜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系；徐式近等[6]利用葉片和莖段作為外植體,對(duì)9 種切花菊進(jìn)行再生誘導(dǎo)；毛洪玉等[7]以葉片為外植體,獲得了中國(guó)紅轉(zhuǎn)基因植株。 但菊花的再生和遺傳轉(zhuǎn)化受到包括基因型、受體材料、抗生素、轉(zhuǎn)化條件等因素的影響[8-11]；在再生和遺傳轉(zhuǎn)化過程中,玻璃化現(xiàn)象也是影響體系穩(wěn)定性、降低再生轉(zhuǎn)化效率的主要因素之一[12],因此不存在適合所有品種的再生及遺傳體系[13]。 而建立品種對(duì)應(yīng)的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系是導(dǎo)入外源基因,驗(yàn)證基因功能的前提[14],因此,建立有效的再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系具有重要意義。 此外,目前已得到的再生及轉(zhuǎn)化體系集中于切花菊及盆栽菊,而關(guān)于匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的研究并不常見。

雨花落英是近年來培育出的匍匐型地被菊新品種,具有匍匐生長(zhǎng)、長(zhǎng)勢(shì)旺盛、分枝性強(qiáng)、花朵繁多、自然花期晚、可粗放管理等特點(diǎn)[15]。 本研究以匍匐型地被菊雨花落英無菌苗幼嫩葉片為外植體,初步建立地被菊品種再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系,以期為進(jìn)一步研究基因功能及運(yùn)用基因工程技術(shù)對(duì)雨花落英進(jìn)行品種改良奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以適齡、健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的匍匐型地被菊雨花落英無菌苗葉片為試驗(yàn)材料,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花種質(zhì)資源保存中心提供；農(nóng)桿菌菌株EHA105 及植物表達(dá)干擾載體pMDC32-ami-CmERF12 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院菊花實(shí)驗(yàn)室保存。

本試驗(yàn)采用的基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基,其中MS粉(HB8469-5)購自青島海博生物公司；蔗糖購自廣東西隴科學(xué)有限公司；瓊脂(A8190)、羧芐青霉素(Carbenicillin,Carb,C8250)、 潮 霉 素(Hygromycin,Hyg,H8080)、萘乙酸(Naphthalene-acetic acid,NAA,N8010)、6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA,A8170)、激動(dòng)素(6-KT,IK0060)均購自北京索萊寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲取 以地被菊品種雨花落英帶頂芽或幼嫩側(cè)芽的莖段為外植體,流水沖洗1 ～2 h 后,在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行以下操作：75%酒精消毒30 s,無菌水沖洗2～3 次,0.1% HgCl2溶液浸泡消毒5 min,無菌水沖洗3～4 次；隨后將莖段放置于濾紙上,無菌風(fēng)吹干莖段表面水分；最后將其切成0.5 ～1.0 cm 帶腋芽的小段,接種于普通MS 培養(yǎng)基上,培養(yǎng)約15 d 后,將長(zhǎng)成的無菌苗切成帶頂芽或腋芽的小段,接種于新的MS 培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng),此后每30 d 繼代培養(yǎng)1 次,以獲得后續(xù)試驗(yàn)所需組培苗。

1.2.2 不同苗齡組培苗的葉盤再生 選取苗齡分別為25、30、40 d 的長(zhǎng)勢(shì)良好的組培苗,取頂端2～4 片幼葉,在超凈工作臺(tái)無菌環(huán)境下,去除葉脈,切成0.5 cm×0.5 cm 的葉盤,保證葉盤四邊均有切口,接種于再生培養(yǎng)基中。 每處理接種30 個(gè)外植體,接種于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,每處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。 培養(yǎng)皿為直徑90 mm 塑料培養(yǎng)皿,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件：光周期16 h 光照/8 h 黑暗,培養(yǎng)溫度為25℃(下同)。每隔15 d 繼代培養(yǎng)1 次,40 d 后統(tǒng)計(jì)葉盤不定芽再生情況,從而確定葉盤再生時(shí)所選擇的組培苗的最適苗齡。

1.2.3 不同激素配比篩選 選取苗齡為30 d、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗,取頂端幼葉切成葉盤,接種于含不同濃度配比的6-BA 和NAA 的MS 再生培養(yǎng)基上。 預(yù)試驗(yàn)設(shè)置6-BA 濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1,NAA 濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg·L-1；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)觀察到的試驗(yàn)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),進(jìn)一步細(xì)化6-BA 和NAA 的濃度和配比。 每個(gè)處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù)。 每15 d 繼代1 次,40 d 后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算葉片再生率和平均芽數(shù)：

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

選取苗齡為30 d、生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗,以已得到的最適再生培養(yǎng)基為基礎(chǔ),進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

LAN Gang, WANG Xi-yong, GUO Da-wei, XIAO Huai-qing, XU Zhu-hui, ZHANG Zhi-hao

1.3.1 潮霉素濃度的篩選 為確定潮霉素濃度,避免其對(duì)葉盤再生分化的抑制,將正常葉盤分別接種于分別含有0、5、8、10、12、15 mg·L-1潮霉素的再生培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1,下同)上,每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),培養(yǎng)20 d 后觀察葉盤生長(zhǎng)狀況和再生情況,確定適宜的潮霉素濃度；為確定潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗的臨界值,將雨花落英組培苗分別繼代培養(yǎng)至含有0、5、8、10、12、15 mg·L-1潮霉素的MS 培養(yǎng)基上,每處理接種20 個(gè)外植體于8 ～9 個(gè)組培瓶中,設(shè)3 次重復(fù),20 d 后觀察其生根情況,從而確定轉(zhuǎn)基因苗的潮霉素生根篩選濃度。

1.3.2 羧芐青霉素濃度的篩選 將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的雨花落英葉盤分別接種于添加0、100、200、300、400 mg·L-1羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基上,每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),培養(yǎng)5 d 后,觀察其對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用；用無菌水沖洗掉葉盤表面農(nóng)桿菌,放置于新的培養(yǎng)基上,統(tǒng)計(jì)葉盤存活率。

1.3.3 遺傳轉(zhuǎn)化條件的篩選 1)培養(yǎng)時(shí)間的確定：將葉盤置于再生培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),預(yù)培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為0、1、2、3 d,其他培養(yǎng)條件相同。 每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)情況,統(tǒng)計(jì)延遲培養(yǎng)后的葉盤存活率以及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的抗性芽再生率,從而確定最適預(yù)培養(yǎng)時(shí)間；

2)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間確定：將葉盤在再生培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d 后,采用農(nóng)桿菌侵染液進(jìn)行侵染,侵染時(shí)間分別設(shè)置為3、5、7、10、15 min,其他培養(yǎng)條件相同。 每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)情況,統(tǒng)計(jì)葉盤存活率以及抗性芽再生率,從而確定最適合的農(nóng)桿菌侵染時(shí)間；

3)共培養(yǎng)時(shí)間的確定：由于農(nóng)桿菌只有在黑暗條件下才能將其所攜帶的質(zhì)粒整合到植物的基因組中,因此需要將葉盤與農(nóng)桿菌進(jìn)行一定時(shí)間的共同暗培養(yǎng)。 將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的葉盤接種于新的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。 共培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、5、7 d,其他培養(yǎng)條件相同。 每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)狀況,統(tǒng)計(jì)葉盤存活率以及抗性芽再生率,從而確定最適合的共培養(yǎng)(暗)時(shí)間；

4)延遲培養(yǎng)時(shí)間的確定：經(jīng)過2 d 的共培養(yǎng)后,將葉盤轉(zhuǎn)入含有羧芐青霉素的延遲培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1+Carb 400 mg·L-1)上進(jìn)行脫菌培養(yǎng),延遲培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為0、3、5、7、9 d,隨后轉(zhuǎn)入含有一定濃度的羧芐青霉素和潮霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)狀況,統(tǒng)計(jì)抗性芽再生率,從而確定最適合的延遲培養(yǎng)時(shí)間；

5)6-KT 培養(yǎng)濃度確定：葉盤經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)及延遲培養(yǎng)后,置于含有在一定濃度的羧芐青霉素和潮霉素的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),每15 d 繼代1 次,根據(jù)篩選出的潮霉素選擇壓逐步降低潮霉素濃度培養(yǎng)45 d 后,向培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-KT,觀察其對(duì)不定芽再生的影響。 6-KT 濃度分別設(shè)置為0、0.25、0.5 mg·L-1,每處理接種30 個(gè)外植體于2 個(gè)培養(yǎng)皿中,設(shè)3 次重復(fù),觀察葉盤生長(zhǎng)狀況,統(tǒng)計(jì)抗性芽再生率,從而確定最適合的6-KT 培養(yǎng)濃度。

1.4 玻璃化苗的恢復(fù)

在遺傳轉(zhuǎn)化過程中,雨花落英葉盤及再生芽不可避免地出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。 調(diào)整篩選培養(yǎng)基中蔗糖及6-BA 濃度,蔗糖濃度分別設(shè)置為30、40、50 g·L-1,6-BA 濃度分別設(shè)置為2.0、1.5、1.0 mg·L-1,觀察玻璃化苗的恢復(fù)情況。

1.5 轉(zhuǎn)基因菊花的檢測(cè)

1.5.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè) 將得到的抗性芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中,2 周后觀察其生根情況。 對(duì)在生根培養(yǎng)基上成功生根的抗性苗提取DNA,分別使用2對(duì)引物(Hyg-F、Hyg-R 和35S、Ⅱ)檢測(cè)其是否為轉(zhuǎn)基因陽性苗。 其中,第1 對(duì)引物根據(jù)pMDC32 載體上的潮霉素抗性序列設(shè)計(jì)；第二對(duì)引物以pMDC32 載體上的CaMV35S 啟動(dòng)子序列為模板設(shè)計(jì)前引物,以基因特異引物Ⅱ?yàn)楹笠铩?/p>

1.5.2 RT-qPCR 驗(yàn)證基因的相對(duì)表達(dá)量 對(duì)普通PCR 檢測(cè)確定的陽性苗進(jìn)行擴(kuò)繁繼代15 d 后,取長(zhǎng)勢(shì)相同的組培苗相同葉位的葉片,提取植物總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以菊花EF1α(登錄號(hào)：KF305681)基因作為內(nèi)參對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性苗中的CmERF12 基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 組培苗最適苗齡及不同激素配比對(duì)葉盤再生的影響

由表1可知,在相同苗齡期,當(dāng)6-BA 濃度一定時(shí),除苗齡為40 d 外,不定芽的再生率均隨著NAA 濃度的提高而呈上升趨勢(shì)。 當(dāng)6-BA 濃度達(dá)到3.0 mg·L-1時(shí),不同苗齡期的葉盤再生率均最低,有的苗齡期不定芽的分化率甚至為0；苗齡為30 d 時(shí)的組培苗與其他苗齡期相比,在不同激素濃度分配下葉盤再生率均最高。 苗齡為40 d 時(shí)的組培苗的葉盤再生效果最差,再生率最高僅64.76%,此時(shí)培養(yǎng)基中,6-BA 濃度為2.0 mg·L-1,NAA 濃度為1.0 mg·L-1。 苗齡為25 d 時(shí)的組培苗葉盤在6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1和6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 為1.0 mg·L-1條件下,再生率分別為80.37%和71.22%,二者間差異不顯著但顯著高于其他處理。 試驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)苗齡為25 d 的組培苗葉片再生出的不定芽存在不同程度的玻璃化現(xiàn)象,不利于遺傳轉(zhuǎn)化。 苗齡30 d 的組培苗,葉盤再生率最高的激素組合為6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1,再生率為76.25%,但不同的重復(fù)之間存在著較大的差異；其次是6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1,再生率為72.78%,二者間差異不顯著。 綜上,初步篩選出組培苗最適苗齡為30 d,最適激素配比為6-BA 1.0 ～2.0 mg·L-1,NAA 0.5～1.0 mg·L-1,由于篩選出的最高葉盤再生率低于80%,因此在苗齡30 d 的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)激素濃度配比進(jìn)行篩選。

在初篩預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以30 d 苗齡的無菌苗葉片為外植體,進(jìn)一步細(xì)化6-BA 和NAA 的濃度和配比最終將6-BA 濃度分別設(shè)為1.0、1.5、2.0 mg·L-1,NAA 濃度分別設(shè)為0.5、0.6、1.0 mg·L-1。 結(jié)果表明,在當(dāng)前處理濃度下,愈傷膨大疏松,均有不定芽發(fā)生。其中,6-BA 濃度為1.5 mg·L-1,NAA 濃度為0.8 mg·L-1時(shí),葉盤顏色鮮綠,再生率最高,達(dá)91.11%；培養(yǎng)2～3 周后有綠色芽點(diǎn)發(fā)生,且不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好,整齊一致,平均芽數(shù)高達(dá)5.90,適合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(圖1-E,表2)。 當(dāng)6-BA 濃度為2.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.5 mg·L-1及6-BA 濃度為2.0 mg·L-1、NAA 濃度為0.5 mg·L-1時(shí),葉盤再生率和平均芽數(shù)均為最低,愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好,但不定芽發(fā)生較少(圖1-D、G,表2)。 綜上,確定葉盤分化培養(yǎng)基最佳配比為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1。

表1 不同苗齡及激素配比對(duì)雨花落英葉盤再生的影響Table1 Effects of seedling age and plant hormone on regeneration of Yuhualuoying

表2 不同激素配比對(duì)雨花落英葉盤再生的影響Table2 Effects of plant hormone ratio on regeneration of Yuhualuoying

2.2 潮霉素濃度的確定

由圖2、圖3可知,雨花落英葉盤對(duì)潮霉素較為敏感,當(dāng)再生培養(yǎng)基中未添加潮霉素時(shí),愈傷組織膨大,呈鮮綠色,不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好(圖3-A)；隨著潮霉素濃度的增加,葉盤組織的褐死率逐漸升高,且不定芽的再生率逐漸降低。 潮霉素濃度為5 mg·L-1時(shí),組織存活率較高,約為72.69%,葉盤邊緣組織褐化,不定芽的再生開始受到抑制,部分葉盤壞死且無不定芽的產(chǎn)生,但仍具55.81%的再生率(圖3-B)；當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到8 mg·L-1時(shí),葉盤褐化,呈焦炭狀,50%以上的組織死亡,不定芽的再生受到嚴(yán)重抑制,僅有17.93%的再生率,芽點(diǎn)黃化,生長(zhǎng)異常(圖3-C)；當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí),葉盤失水,生長(zhǎng)異常,組織褐死率高達(dá)84.97%,僅有6.82%的不定芽再生(圖3-D)；當(dāng)潮霉素濃度高于12 mg·L-1時(shí),葉盤壞死,停止生長(zhǎng),不定芽的再生完全被抑制,無不定芽的產(chǎn)生(圖3-D、F)。 因此潮霉素抑制不定芽再生分化的臨界值為12 mg·L-1。為保證葉盤能夠在含有潮霉素的培養(yǎng)基上分化,其篩選濃度應(yīng)低于致死的臨界值,因此在遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中,設(shè)置潮霉素葉盤篩選的選擇壓為8 ～10 mg·L-1,且在培養(yǎng)過程中逐漸降低潮霉素濃度,降低潮霉素對(duì)葉盤的抑制作用。

圖1 不同激素配比下雨花落英葉盤再生情況Fig.1 Regeneration of Yuhualuoying in different plant hormone ratios

圖3 不同潮霉素濃度下的葉盤狀態(tài)Fig.3 State of leaf disk under different Hygromycin concentrations

圖4 潮霉素濃度對(duì)雨花落英生根的影響Fig.4 Effects of Hygromycin concentration on regeneration of Yuhualuoying

由圖4可知,根系對(duì)潮霉素的反應(yīng)較敏感,潮霉素對(duì)雨花落英根系生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。 當(dāng)培養(yǎng)基中無潮霉素添加時(shí),根系及葉片生長(zhǎng)正常,根多且健壯(圖5-A)。 隨著潮霉素濃度的增加,雨花落英生根率逐漸降低,這與葉盤的反應(yīng)一致。 在加入潮霉素的培養(yǎng)基中,雖然有根系的生成,與正常培養(yǎng)基中的根系相比較低且根較柔弱(圖5-B),或呈現(xiàn)出明顯的木質(zhì)化,根系生長(zhǎng)到一定階段時(shí)受到抑制,當(dāng)潮霉素濃度為8～10 mg·L-1時(shí),植株部分葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象(圖5-C、D)；當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到12 mg·L-1以上時(shí),表現(xiàn)為植株弱小,植株停止生長(zhǎng),葉片白化,整株死亡(圖5-E、F)。綜上,潮霉素生根篩選濃度為11 mg·L-1。

2.3 羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制情況

圖5 不同潮霉素濃度下的根系生長(zhǎng)狀況Fig.5 Root state under different Hygromycin concentrations

由表3可知,在添加了不同濃度羧芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后,農(nóng)桿菌的抑制狀況和葉盤的生長(zhǎng)狀態(tài)完全不同。 在不添加羧芐青霉素的培養(yǎng)基上,農(nóng)桿菌大量生長(zhǎng),布滿培養(yǎng)皿和所有葉盤表面,葉盤變軟褐化死亡；羧芐青霉素濃度為100 mg·L-1時(shí),仍有較多菌落出現(xiàn),經(jīng)過無菌水沖洗,只有極少葉盤存活,但存活的葉盤變軟,表面有褐狀斑塊,且無法繼續(xù)生長(zhǎng)形成愈傷；當(dāng)羧芐青霉素濃度逐漸升高,培養(yǎng)皿及葉盤周圍的農(nóng)桿菌菌落逐漸減少；當(dāng)羧芐青霉素濃度達(dá)到300 mg·L-1時(shí),只有很少的農(nóng)桿菌菌落散布于部分葉盤周圍,且葉盤能夠正常生長(zhǎng)和脫分化形成愈傷組織,組織嫩綠、健康、致密,長(zhǎng)勢(shì)良好,葉盤存活率為65.56%,與其他處理差異顯著；當(dāng)羧芐青霉素濃度為400 mg·L-1時(shí),農(nóng)桿菌被完全抑制,且愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好,葉盤存活率最高為100%,顯著高于其他處理。 綜上,設(shè)置延遲培養(yǎng)基中,羧芐青霉素篩選濃度為400 mg·L-1。

表3 羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果及葉盤生長(zhǎng)情況Table3 Effects of Carb on agrobacterium inhibition and explant growth

2.4 轉(zhuǎn)化條件的確定

2.4.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖6可知,預(yù)培養(yǎng)可以明顯降低農(nóng)桿菌對(duì)葉盤的傷害。 未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的葉盤在侵染后,即使使用了羧芐青霉素抑制農(nóng)桿菌,仍存在農(nóng)桿菌爆發(fā)現(xiàn)象,所有葉盤均被農(nóng)桿菌污染,存活率為0；預(yù)培養(yǎng)2 d 的葉盤存活率高達(dá)90%以上,且抗性芽再生率最高,為13.57%；預(yù)培養(yǎng)3 d 的葉盤存活率達(dá)到100%,預(yù)培養(yǎng)2 d 和3 d 的葉盤存活率顯著高于其他處理,但預(yù)培養(yǎng)3 d 的再生得到的抗性芽數(shù)較少,僅有7.06%的再生率,多數(shù)葉盤在培養(yǎng)后期褐化死亡。 綜上,預(yù)培養(yǎng)最適時(shí)間為2 d。

圖6 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effects of pre-culture time on genetic transformation

2.4.2 侵染時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖7可知,侵染時(shí)間對(duì)葉盤遺傳轉(zhuǎn)化有顯著影響,隨著侵染時(shí)間增加,葉盤存活率逐漸降低,當(dāng)侵染時(shí)間低于3 min 時(shí),無法產(chǎn)生抗性愈傷和抗性芽點(diǎn),當(dāng)侵染時(shí)間為7 min時(shí),抗性芽再生率最高；當(dāng)浸染時(shí)間高于7 min 時(shí)農(nóng)桿菌對(duì)葉盤的傷害明顯,葉盤存活率和抗生素再生率均顯著降低；侵染時(shí)間為15 min 時(shí),無葉盤存活和抗性芽再生。 綜上,侵染時(shí)間設(shè)置為5 ～7 min 最適宜。 抗性芽再生率在侵染時(shí)間為5 min 和7 min 時(shí)無顯著性差異,而侵染時(shí)間為5 min 時(shí),葉盤存活率為96.67%,顯著高于7 min 時(shí)的葉盤存活率,因此確定最佳的侵染時(shí)間為5 min。

圖7 侵染時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effects of infection time on genetic transformation

2.4.3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖8可知,隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加,葉盤存活率逐漸降低,而抗性芽再生率呈先上升后降低的趨勢(shì),這與葉盤外植體對(duì)侵染時(shí)間的反應(yīng)相似。 共培養(yǎng)時(shí)間為1 d 時(shí),抗性芽再生率較低,為3.45%；共培養(yǎng)時(shí)間為2 d 時(shí),抗性芽再生率雖與3 d 時(shí)無顯著差異,但共培養(yǎng)2 d 時(shí)的葉盤存活率顯著高于共培養(yǎng)3 d 時(shí)的葉盤存活率。 因此,選擇最佳的共培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

圖8 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.8 Effects of co-culture time on genetic transformation

2.4.4 延遲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖9可知,未經(jīng)延遲培養(yǎng)的葉盤無抗性芽生成,表明一定時(shí)間的延遲培養(yǎng)是必須的；隨著延遲培養(yǎng)時(shí)間的增加,抗性芽再生率呈先增加后降低的趨勢(shì),延遲培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí),抗性芽再生率最高,且顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間；當(dāng)延遲培養(yǎng)時(shí)間大于5 d 時(shí),愈傷組織變硬,呈焦炭狀,部分變褐,無分化能力。 綜上,延遲培養(yǎng)最適時(shí)間為5 d。 此時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)良好,且抗性芽再生能力較強(qiáng)。

圖9 延遲培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化的影響Fig.9 Effects of postponed culture time on genetic transformation

2.4.5 6-KT 對(duì)葉盤遺傳轉(zhuǎn)化的影響 由圖10 可知,在不添加6-KT 的篩選培養(yǎng)基中,抗性芽再生率較低,為2.22%；6-KT 濃度為0.25 mg·L-1時(shí),抗性芽再生率達(dá)到15.71%,顯著高于不加6-KT 處理；6-KT 濃度為0.5 mg·L-1時(shí),抗性芽再生率又降至7.85%,仍高于不加6-KT 處理,但差異不顯著。 綜上,添加0.25 mg·L-1的6-KT 能夠顯著提高抗性芽的再生率。

2.5 玻璃化再生苗的恢復(fù)

圖10 6-KT 對(duì)葉盤轉(zhuǎn)化再生的影響Fig.10 Effects of 6-KT on genetic transformation

經(jīng)過對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化過程中各個(gè)條件的優(yōu)化,獲得了15.71%的不定芽再生率,但試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)葉盤上再生出的抗性芽均有不同程度的玻璃化現(xiàn)象。 由表4可知,調(diào)整6-BA 和蔗糖濃度能夠使玻璃化的菊花苗恢復(fù)正常。 當(dāng)蔗糖濃度固定不變時(shí),隨著6-BA 濃度的增加,玻璃化苗的恢復(fù)率逐漸降低,且有顯著性差異。當(dāng)6-BA 濃度不變時(shí),蔗糖濃度增加整體上玻璃化苗的恢復(fù)率逐漸增加,但當(dāng)蔗糖濃度高于40 g·L-1時(shí),對(duì)玻璃化苗的恢復(fù)率無明顯提高。 因此,使玻璃化苗恢復(fù)的最適培養(yǎng)基中,應(yīng)加入的6-BA 濃度為1.0 mg·L-1、蔗糖濃度為40 g·L-1,此時(shí)玻璃化苗的恢復(fù)率為100%。 此外,本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用普通組培瓶蓋為封口材料時(shí),由于透氣性差,瓶?jī)?nèi)相對(duì)濕度較大,不利于玻璃化苗的恢復(fù)；當(dāng)使用封口膜為封口材料時(shí),由于透氣性太強(qiáng),培養(yǎng)基很快失水萎縮,不利于組培苗的生長(zhǎng),因此選用帶有透氣口的組培瓶蓋為封口材料總體效果最佳。

表4 不同蔗糖和6-BA 濃度對(duì)玻璃化苗恢復(fù)的影響Table4 Effects of different concentrations of sucrose and 6-BA on vitrification recovery

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的獲得與分子鑒定

2.6.1 雨花落英轉(zhuǎn)基因株系的獲得 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化地被菊雨花落英：取苗齡為30 d 的組培苗頂端幼嫩葉片,切成0.5 cm×0.5 cm 的葉盤,接種于再生培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2 d(圖11-A)。 將葉盤置于農(nóng)桿菌侵染液中侵染5 min,取出后用無菌濾紙吸干侵染液,并將葉盤置于新的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d,轉(zhuǎn)入添加400 mg·L-1的羧芐青霉素的再生培養(yǎng)基上延遲培養(yǎng)5 d,之后轉(zhuǎn)入到篩選培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1+Hyg 10 mg·L-1)培養(yǎng)。 由于葉盤在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被吸收而逐漸減少,因此每15 d 繼代至新的培養(yǎng)基上,同時(shí)將NAA 濃度逐漸降低,以模擬在理想培養(yǎng)狀態(tài)下葉盤所處的激素環(huán)境(6-BA 與NAA 比例逐漸升高)。 在此過程中,葉盤不斷生長(zhǎng)、膨大,產(chǎn)生抗性愈傷組織(圖11-B)。 繼代3 次后,將葉盤轉(zhuǎn)入到添加0.25 mg·L-16-KT 的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至有抗性芽點(diǎn)發(fā)生,抗性不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,部分愈傷無法分化,逐漸黃化或褐化(圖11-C)。 調(diào)整培養(yǎng)基中6-BA 的濃度為1.0 mg·L-1,蔗糖濃度為40 g·L-1,使玻璃化苗恢復(fù)正常(圖11-D)。 將小苗切成單株,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+Hyg 11 mg·L-1)中進(jìn)行篩選,去除白化、黃化以及不能正常生長(zhǎng)生根的植株,其余植株能夠正常生根,根系及葉片生長(zhǎng)正常,根多且健壯的被認(rèn)為是抗性植株(圖11-E、F)。 最終獲得抗性生根植株約60 株。

2.6.2 轉(zhuǎn)基因植株在基因組水平上的PCR 檢測(cè) 對(duì)生根篩選得到的部分抗性苗進(jìn)行DNA 水平的鑒定。以清水為模板作為對(duì)照以排除操作失誤的可能性(CK1),以雨花落英野生型(WT)的DNA 為模板作為陰性對(duì)照(CK2),以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照(CK3)。 由圖12 可知,在被鑒定的15 株抗性苗中,有10 株(株系1、3、5、6、7、8、10、11、12、14)用2 對(duì)引物的PCR 檢測(cè)均擴(kuò)增出大小正確的目的條帶,與陽性對(duì)照大小一致。其余未擴(kuò)增出目的條帶,或者只有1 對(duì)引物擴(kuò)增出了條帶。 清水對(duì)照和WT 均未擴(kuò)增出目的條帶,說明試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。 這10 株抗性苗被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因陽性苗,其他的抗性苗為假陽性,假陽性概率為33.3%。2.6.3 RT-qPCR 驗(yàn)證基因的相對(duì)表達(dá)量 以菊花EF12 基因?yàn)閮?nèi)參基因,對(duì)經(jīng)過DNA 水平驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因陽性苗進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量,用同批的WT 作為對(duì)照。 定量驗(yàn)證結(jié)果表明,在10 株陽性苗中,9 個(gè)株系的CmERF12 基因均受到了明顯的抑制表達(dá),其中株系3、株系6、株系7 和株系12 的相對(duì)表達(dá)量最低,分別是WT 的0.48 倍、0.48 倍、0.45 倍和0.45 倍,株系1 和株系14 分別是WT 的0.53 倍和0.52 倍；株系5、株系8 和株系10 分別是WT 的0.58倍、0.61 倍和0.61 倍。 株系11 的表達(dá)量變化最小,為WT 的0.91 倍(圖13)。

圖11 轉(zhuǎn)基因抗性植株過程Fig.11 Regeneration process of transgenic resistant plants

3 討論

近年來,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在菊花轉(zhuǎn)基因研究中得到廣泛運(yùn)用,為菊花性狀改良提供了新思路[16]。 菊花的離體再生受多種因素的影響,如吳友根[17]研究表明,當(dāng)以葉片為外植體進(jìn)行植株再生時(shí),幼嫩葉片比成熟葉片有更高的再生效率。 本研究中,當(dāng)組培苗苗齡為30 d 時(shí),其葉片再生率明顯高于苗齡為25 d 和40 d 的組培苗葉片,與前人研究存在差異。繼代培養(yǎng)40 d 后的組培苗在各種再生培養(yǎng)基上的再生頻率均低于65%,其原因可能是組培苗苗齡較大,葉片組織脫分化和再分化能力較弱,再生為新植株的能力相對(duì)較弱[18]。 而苗齡為25 d 的組培苗葉片,雖然在部分培養(yǎng)基上再生率高于80%,但是在培養(yǎng)后期,再生芽出現(xiàn)不同程度的玻璃化,因此不適合作為雨花落英再生條件,可能是由于苗齡較小,植株含水量較高,造成玻璃化現(xiàn)象[7]。 Naing 等[10]研究表明,葉盤進(jìn)行芽的分化還受培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素濃度及配比的影響。 本研究中,最適的再生培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1。 同為匍匐型地被菊,本研究中雨花落英最適再生培養(yǎng)基與崔新利等[18]篩選出的雨花勛章的最適培養(yǎng)基配方不同,這可能是由于不同的基因型和品種對(duì)于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素的敏感性不同,表明不同植物類型、不同品種,甚至不同的生長(zhǎng)狀態(tài)下,再生體系不能通用,需要進(jìn)一步篩選。

圖12 部分轉(zhuǎn)基因抗性苗DNA 水平鑒定結(jié)果Fig.12 Identification of partial transgenic seedlings at DNA level

圖13 轉(zhuǎn)基因陽性苗定量驗(yàn)證Fig.13 Relative expression level of the positive transgenic seedlings

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法是一種常用的獲得轉(zhuǎn)基因苗、研究基因功能的基因工程手段[14]。 轉(zhuǎn)化效率受侵染液濃度、侵染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等諸多因素的影響[19]。 本研究在獲得匍匐型地被菊雨花落英最適再生培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的各個(gè)因素做進(jìn)一步研究,獲得了最優(yōu)的遺傳轉(zhuǎn)化組合。 轉(zhuǎn)化過程中,常用的抗生素有兩類,一類用于抑制農(nóng)桿菌的爆發(fā),如羧芐青霉素、頭孢噻肟、特美汀等[20-21]；另一類用于初步篩選轉(zhuǎn)基因的抗性植株,如卡那霉素和潮霉素[22-23]。 本研究分別采用羧芐青霉素和潮霉素作為抑菌和篩選抗生素,按照優(yōu)化的體系,得到了轉(zhuǎn)基因抗性植株,但僅有2.22%的轉(zhuǎn)化率。 6-KT 是一種細(xì)胞分裂素類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,可以與其他激素共同作用于植物外植體的分化與再生[24]。 本研究發(fā)現(xiàn)加入0.25 mg·L-16-KT 的培養(yǎng)基可以獲得更高的抗性芽再生率(15.71%),這可能是由于6-KT 可以與6-BA 起到協(xié)同作用,促進(jìn)愈傷組織塊細(xì)胞分裂和芽的分化,與房順達(dá)等[25]在梅花離體培養(yǎng)研究中得到的結(jié)論一致。 但6-KT 是在葉盤培養(yǎng)后期加入到篩選培養(yǎng)基中的,在培養(yǎng)初期加入一定量的6-KT 是否能更有效地提高遺傳轉(zhuǎn)化效率還需要進(jìn)一步研究。

玻璃化現(xiàn)象是組織培養(yǎng)過程中,組培苗普遍存在的一種水漬狀、半透明的病態(tài)生理現(xiàn)象[12]。 1981年,Debergh 等[26]通過研究菊科植物扶郎和洋薊首次提出玻璃化現(xiàn)象。 玻璃化苗恢復(fù)正常的難度較大,嚴(yán)重影響再生和轉(zhuǎn)化體系的穩(wěn)定性,前人研究中一旦出現(xiàn)玻璃化問題,試驗(yàn)就會(huì)被認(rèn)定為失敗,玻璃化苗也會(huì)被放棄[27]。 呂亞鳳等[28]研究發(fā)現(xiàn),玻璃化率隨著6-BA 濃度的升高而增加,而李瓊潔等[29]則認(rèn)為,6-BA 濃度過高或過低,均不利于玻璃化苗的恢復(fù)。 也有研究表明,提高蔗糖濃度可以有效防止玻璃化的發(fā)生[30]。 在本研究中,較高濃度的6-BA 是抗性芽發(fā)生的必要條件,而在此條件下,玻璃化的現(xiàn)象無法避免,此外本試驗(yàn)通過提高蔗糖濃度,降低6-BA 濃度,將玻璃化苗成功轉(zhuǎn)化為正常苗,從而節(jié)約了時(shí)間成本。 但關(guān)于如何避免玻璃化苗的形成還需進(jìn)一步研究。

在得到轉(zhuǎn)基因抗性植株后,采用PCR 和RT-qPCR進(jìn)行分子鑒定,是基因工程的必要過程[31]。 本研究通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)外源基因已成功轉(zhuǎn)入雨花落英植株中,并能夠在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因的表達(dá),表明通過建立的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系可以成功獲得雨花落英轉(zhuǎn)基因植株。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,以苗齡為30 d 的組培苗幼嫩葉片為外植體,以MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1為再生培養(yǎng)基,是一種較為理想的誘導(dǎo)地被菊雨花落英葉盤再生的方法,此時(shí)葉盤再生率最高,達(dá)91.11%,平均芽數(shù)高達(dá)5.90。 在此基礎(chǔ)上,用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行葉盤外植體遺傳轉(zhuǎn)化,預(yù)培養(yǎng)2 d,侵染5 min,共培養(yǎng)2 d,延遲培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行選擇培養(yǎng),可以得到轉(zhuǎn)基因抗性植株。 400 mg·L-1羧芐青霉素能夠在不影響葉盤分生生長(zhǎng)的情況下有效抑制農(nóng)桿菌的爆發(fā)；潮霉素能夠?qū)﹃栃悦邕M(jìn)行篩選,顯著降低轉(zhuǎn)基因苗的假陽性,假陽性概率僅為33.3%；培養(yǎng)后期加入0.25 mg·L-16-KT 可以有效提高抗性芽的再生率,但是否可以在培養(yǎng)初期加入一定量的6-KT,以提高遺傳轉(zhuǎn)化效率仍需進(jìn)一步研究；調(diào)節(jié)6-BA 濃度為1.0 mg·L-1,蔗糖濃度為40 g·L-1,可以將得到的玻璃化苗轉(zhuǎn)化為正常苗,這在一定程度上避免了玻璃化苗被遺棄造成的資源浪費(fèi)的現(xiàn)象；然而針對(duì)如何通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來避免玻璃化苗的產(chǎn)生,提高遺傳轉(zhuǎn)化效率,仍需進(jìn)一步研究。 本研究通過雨花落英葉盤的再生和遺傳轉(zhuǎn)化,得到了轉(zhuǎn)基因抑制株系,為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因植株表型,驗(yàn)證基因功能提供了原材料,同時(shí)為通過外源基因遺傳轉(zhuǎn)化改良地被菊性狀奠定了一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。