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        高效液相色譜法測定不同類別食品中的葉黃素

        2019-08-27 10:06:46222

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        (1.中國廣州分析測試中心, 廣東廣州510070;2.廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州510070)

        葉黃素屬于類胡蘿卜素,是一種天然、營養(yǎng)和多功能的食品添加劑,素有“植物黃金”之稱[1-3]。人體自身不能合成葉黃素,只能從食物中攝取[4]。我國衛(wèi)生部已批準(zhǔn),葉黃素可添加到嬰幼兒配方食品中,因此葉黃素一直都是功能食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

        食品中添加的葉黃素有三種形態(tài):葉黃素單體、葉黃素微囊粉或葉黃素酯。葉黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)共軛雙鍵,容易被氧化失去原有的生物活性,因此葉黃素單體的應(yīng)用范圍受到限制[5-6]。葉黃素微囊粉是通過微膠囊化技術(shù)對葉黃素單體進(jìn)行包埋的微囊產(chǎn)品,可最大限度保持葉黃素的生物活性,同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)緩釋吸收[6-7]。微囊中葉黃素的檢測,需要先破微囊壁,再提取葉黃素。葉黃素酯是葉黃素與脂肪酸(如棕桐酸、月桂酸等)作用生成的酯類衍生物,屬于新資源食品。葉黃素酯種類很多,但經(jīng)過堿性皂化(水解)均可生成葉黃素單體[8]。葉黃素微囊粉和葉黃素酯穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉黃素單體,更便于貯藏和應(yīng)用。

        葉黃素形態(tài)不同,決定了樣品前處理方法不同。目前,在現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法和相關(guān)文獻(xiàn)中,主要是根據(jù)樣品基質(zhì)選擇樣品前處理方法[9-13]。本文對不同類別食品中不同形態(tài)的葉黃素分別進(jìn)行了研究,建立了有針對性的樣品前處理方法。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 儀器與試劑

        高效液相色譜儀—二極管陣列檢測器( LC-20A 2300,日本島津公司);KQ-2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(Hitachi);電熱恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司);BT125D電子天平(Sartorius);KL512型氮吹儀(北京康林科技有限責(zé)任公司)。

        甲醇(色譜純 Merck );乙腈、乙醚、丙酮、石油醚、無水乙醇、抗壞血酸(分析純 廣州化學(xué)試劑廠);2,6-二叔丁基對甲酚(BHT 阿拉丁);蒸餾水。

        乙醇提取劑:稱取 0.75 g BHT于 500 mL容量瓶中,用無水乙醇溶解并定容。甲醇、丙酮和乙腈提取劑均含 0.15 % BHT。

        1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

        葉黃素(95.8 %,ChromaDex):精密稱取0.010 44 g(精確至0.01 mg)于100 mL棕色容量瓶中,用無水乙醇溶解并定容至刻度,得到濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取 0.125、0.250、0.500、2.00、5.00、10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于6個(gè) 100 mL 棕色容量瓶中,用無水乙醇定容,得到濃度為0.125、0.250、0.500、2.00、5.00、10.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

        1.3 樣品前處理

        含有葉黃素單體、葉黃素微囊粉或葉黃素酯的樣品,前處理方法分別選用超聲波輔助提取法、酶解—超聲波提取法或堿皂化—液液萃取法。

        1.3.1 葉黃素單體

        非含油樣品:稱取0.05~5.0 g試樣于 50 mL聚丙烯刻度離心管中,加入 40 mL乙醇提取劑,于冰水浴中超聲提取 30 min,定容,過濾上機(jī)。

        含油樣品:前處理過程提取劑改為丙酮提取劑,其他步驟同“非含油樣品”。

        1.3.2 葉黃素微囊粉

        微囊壁材種類很多,常見的葉黃素微囊壁材為水溶性壁材和蛋白質(zhì)壁材[14-16]。

        水溶性壁材:稱取0.05~2.0 g試樣于100 mL容量瓶中,加入水15 mL和0.1 g抗壞血酸,渦旋振蕩溶解后于60 ℃ 水浴5 min,不斷震蕩使微囊壁材充分溶解后,加入無水乙醇80 mL,冰水浴超聲提取30 min,用無水乙醇定容,過濾上機(jī)。

        蛋白質(zhì)壁材:稱取0.05~2.0 g試樣于100 mL容量瓶中,加入15 mL 水、0.1 g抗壞血酸和0.15 g胰蛋白酶,以下步驟同“水溶性壁材”。

        1.3.3 葉黃素酯

        葉黃素酯的堿皂化—液液萃取法已經(jīng)成熟,前處理方法參考相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法[9,17]。

        皂化:稱取0.05~2.0 g試樣于250 mL皂化瓶中,加入水10 mL、0.5 g抗壞血酸和無水乙醇40 mL超聲混勻,再加入 50 %氫氧化鉀溶液10 mL,搖勻,于75 ℃ 水浴皂化30 min,皂化后快速冷卻;

        萃?。簩⑸鲜鋈芤阂迫?50 mL分液漏斗中,用石油醚/乙醚(1/1,V/V)50 mL分3次洗滌皂化瓶,洗液并入分液漏斗中,振搖萃取5 min后靜置分層。移取水層,重復(fù)萃取1次,合并醚層;

        洗滌:每次用50 mL蒸餾水洗滌醚層,直至洗至中性;

        濃縮定容:將醚層用氮?dú)獯蹈?,依?jù)葉黃素的線性范圍,用乙醇提取劑定容至合適的體積,過濾上機(jī)。

        1.3.4 高脂肪、高蛋白食品

        對于脂肪和蛋白含量高的食品,如:奶粉、蛋白粉和乳基粉,添加的原料主要是葉黃素單體或者葉黃素微囊粉。但由于樣品基質(zhì)的干擾和葉黃素含量較低,前處理過程需要選用堿皂化—液液萃取法,既可以減少基質(zhì)干擾,還可以濃縮提取液,使其濃度落在葉黃素線性范圍內(nèi)。因此,前處理過程參照“1.3.3節(jié)”。

        1.4 色譜條件:

        色譜柱:迪馬C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測波長:446 nm。流速:1.0 mL/min;流動(dòng)相:水/甲醇(4/96,V/V)。

        圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)色譜Fig.1 Standard chromatogram of lutein

        2 結(jié)果與討論

        2.1 選定檢測波長

        本儀器配備的是光電二極管陣列檢測器,在檢測的同時(shí),還可以獲取葉黃素的紫外可見吸收光譜圖。葉黃素的最大吸收波長為446 nm,選定446 nm作為檢測波長。

        2.2 優(yōu)化流動(dòng)相

        在現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法中[9],葉黃素的流動(dòng)相為甲醇/水/叔丁基甲基醚。叔丁基甲基醚易揮發(fā),有刺激性氣味。優(yōu)化后的流動(dòng)相為水/甲醇(4/96,V/V),該條件簡單易行,環(huán)境友好。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)色譜見圖1。

        2.3 樣品前處理方法選擇

        2.3.1 葉黃素單體選用超聲波輔助提取法

        提取劑的選擇:葉黃素為脂溶性,可溶于大部分有機(jī)溶劑,分別選取甲醇、無水乙醇、丙酮和乙腈為提取劑。前處理過程同“1.3.1節(jié)”。結(jié)果表明:含油樣品,丙酮溶解性最好,提取率最高;對于非含油樣品,甲醇和無水乙醇提取率接近,綜合考慮,選用無水乙醇為提取劑。

        提取劑中BHT濃度 :由于葉黃素的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,需要在提取劑中添加BHT抗氧化劑。前期研究工作表明提取劑中含0.15 %BHT時(shí),提取率最佳[18]。

        2.3.2 葉黃素微囊粉選用酶解—超聲波提取法

        在酶解過程中,需要水浴加熱,加入抗壞血酸可減少葉黃素的氧化分解[19]。

        水溶性壁材:該類壁材遇水即溶,因此加水破壁即可。水用量分別選擇5.0、10.0、15.0、20.0 mL,其他參數(shù)條件不變(樣品為乳基幼兒配方奶粉,稱樣量為2.0 g),具體詳見“1.3.2節(jié)”。每個(gè)水平重復(fù)2次,取平均值,得出水用量與葉黃素含量的關(guān)系見圖2。

        水用量過少,不能充分溶解樣品和破除微囊壁;水用量過多,影響葉黃素提取率和基質(zhì)沉淀率。由圖2可知,水用量為15.0 mL時(shí),測得葉黃素含量最高,選定水用量15.0 mL。由于樣品中葉黃素微囊粉含量不同,最佳水用量也不同,因此,測定不同含量的樣品,需要重新優(yōu)化水的用量。

        蛋白質(zhì)壁材:選擇胰蛋白酶破除微囊壁。酶用量分別選擇0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g,其他參數(shù)條件不變(樣品為葉黃素微囊粉,稱樣量為0.05 g),具體詳見“1.3.2 節(jié)”。每個(gè)水平重復(fù)2次,取平均值,得出酶用量與葉黃素含量的關(guān)系見圖3。

        圖2 水用量對葉黃素含量的影響
        Fig.2 Effect of water dosage ondetermining lutein content

        圖3 酶用量對葉黃素含量的影響
        Fig.3 Effect of enzyme dosage ondetermining lutein content

        由圖3可知,酶用量分別為0.15、0.20、0.25 g時(shí),測得葉黃素含量基本相同。考慮到實(shí)驗(yàn)成本,選定酶用量0.15 g。由于樣品中葉黃素微囊粉含量不同,最佳酶用量也不同,因此,測定不同含量的樣品,需要重新優(yōu)化酶用量。

        2.3.3 葉黃素酯選用的堿皂化—液液萃取法

        葉黃素酯選用的堿皂化—液液萃取法已經(jīng)成熟,前處理方法參考相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法即可,具體步驟見“1.3.3節(jié)”。

        2.4 方法的線性范圍和檢出限

        在優(yōu)化條件下,考察了葉黃素的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示:葉黃素在0.125~10.0 mg/L范圍內(nèi),線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 91。對于奶粉和蛋白粉等食品,當(dāng)取樣量為2.0 g、定容體積為5 mL 時(shí),檢出限為0.10 mg/kg(信噪比S/N=3)。

        2.5 方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

        采用“1.3節(jié)”測定樣品中葉黃素含量,每個(gè)加標(biāo)濃度均做平行樣。求得加標(biāo)回收率為90.0 %~ 102.2 %。平行 6 次實(shí)驗(yàn),求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.29 % ~ 5.84 %,具體結(jié)果見表1。

        表1 葉黃素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 Recoveries and RSDs of lutein in the samples

        2.6 食品中葉黃素的含量情況

        通過對820個(gè)樣品進(jìn)行含量測定,結(jié)果表明,在所檢測的樣品中所含葉黃素含量均不同:①不同品牌、不同年齡段的食品中葉黃素含量不同;②葉黃素軟膠囊的原料為葉黃素單體,硬膠囊為葉黃素微囊粉;③雞蛋中葉黃素主要在蛋黃里,雞的食源種類對蛋黃中葉黃素含量影響很大;④葉黃素微囊粉的壁材主要為水溶性壁材;⑤天然作物中可能同時(shí)含有葉黃素單體和葉黃素酯。樣品前處理要參照“1.3.3節(jié)”。選取有代表性的樣品進(jìn)行列表,按葉黃素形態(tài)不同分為3個(gè)表,具體結(jié)果分別見表2~表4。

        表2 葉黃素單體食品中的檢測結(jié)果Tab.2 Test results of lutein in lutein monomer foods

        表3 葉黃素微囊粉食品中的檢測結(jié)果Tab.3 Test results of lutein in lutein microcapsules foods

        表4 葉黃素酯食品中的檢測結(jié)果Tab.4 Test results of lutein in lutein esters foods

        3 結(jié)論

        本文根據(jù)樣品基質(zhì)和葉黃素形態(tài)不同,分別建立了超聲波輔助提取法、酶解-超聲波提取法、堿皂化-液液萃取法,同時(shí)對其色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過對實(shí)際樣品進(jìn)行測定,結(jié)果表明該方法適用范圍廣、針對性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高和重現(xiàn)性好,可滿足各類食品中葉黃素的檢測。通過對市售的820個(gè)樣品進(jìn)行測定,總結(jié)了常見樣品中葉黃素的存在形式,明確了各類樣品中葉黃素的含量情況,為消費(fèi)者選擇提供數(shù)據(jù)參考。

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