李 紅，劉震雄，竇維佳

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710004； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710038)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)，其中UC為局限于直腸和結(jié)腸黏膜層的慢性非特異性炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為黏膜潰瘍，可出現(xiàn)腹痛、腹瀉或黏液膿血便等[1]。研究顯示，我國UC發(fā)病率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2-3]，然而發(fā)病機制目前尚不明確。微RNA(microRNA,miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼RNA分子，與目標(biāo)基因mRNA的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，因所調(diào)節(jié)下游基因功能的不同，miRNA發(fā)揮不同的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA可介導(dǎo)機體免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腸道屏障功能和微生物群相互作用等多種過程，最終誘發(fā)腸道慢性黏膜炎癥[5-6]。如Paraskevi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，UC患者和健康人群miRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，故推測miRNA可能參與UC的發(fā)生、發(fā)展；Sch?nauen等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-21及miR-223在UC患者血清中的表達(dá)水平顯著高于健康對照；Minacapelli等[9]研究發(fā)現(xiàn)活動期UC患者腸黏膜組織中的miR-206表達(dá)較健康對照及緩解期UC患者明顯上調(diào)，但仍未闡明UC的發(fā)病機制。本研究擬檢測UC患者外周血miR-21及miR-206的表達(dá)情況，并與健康人群進(jìn)行比較，旨在探討miR-21及miR-206與UC發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月至2018年3月空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院消化內(nèi)科住院部及門診部診治的UC患者作為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合IBD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②年齡≥18歲，性別不限；③存在持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉及黏液膿血便等癥狀；④結(jié)腸鏡檢查可見從直腸開始連續(xù)、彌漫分布的糜爛、潰瘍，黏膜血管紋理模糊、紊亂、消失，或結(jié)腸袋變淺、消失，假性息肉和橋形黏膜等；⑤患者或家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)胃腸道腫瘤；②并發(fā)細(xì)菌、病毒、結(jié)核等感染性結(jié)腸炎；③并發(fā)缺血性結(jié)腸炎；④并發(fā)其他型類型的自身免疫性疾病。最終共入選42例患者作為觀察組，其中男22例、女20例，年齡19～67歲，平均(41±13)歲。選擇同期在本科門診進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查且未發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性疾病的42名健康體檢者作為健康對照組，其中男26例、女16例，年齡21～77歲，平均(47±14)歲。兩組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 Trizol LS試劑盒(美國Invitrogen公司生產(chǎn)，批號：10296-028)，PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(日本TaKaRa公司生產(chǎn)，批號：RR037Q)和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(日本TaKaRa公司生產(chǎn)，批號：RR820Q)，4 ℃微量高速離心機(德國Eppendorf公司)，分光光度計(美國Bio-rad 公司)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(瑞士Roche公司)。

1.2.2標(biāo)本采集 采集入選研究對象清晨空腹肘部靜脈血10 mL，置于干燥的無菌試管中，室溫靜置，待其凝固后，置4 ℃(靜置離心后獲得血清，可用低溫離心機保證溫度)，以1 006.2×g，離心10 min，取上清液，置于無RNA酶的無菌試管中，保存于-80 ℃冰箱中待統(tǒng)一檢測。

1.2.3引物合成 所有均由上海生工生物工程公司合成，具體引物序列：miR-21上游引物5′-3′是GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG，下游引物5′-3′是GTGCAGGGTCCGAGGT；miR-206上游引物5′-3′是TGGAGACTTCTGAACGAGAG，下游引物5′-3′是CTTGAAGATGGCGTTGGG；U6上游引物5′-3′是CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物5′-3′是AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4qRT-PCR檢測miRNA表達(dá) ①RNA提取：取250 μL上清液，嚴(yán)格按照Trizol LS試劑盒說明書提取總RNA，紫外分光光度法測量OD值及RNA水平。②逆轉(zhuǎn)錄：取2 μL RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。③PCR擴增：以cDNA為模板應(yīng)用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(共40個循環(huán))。采用2-△△Ct法，以U6作為內(nèi)參，分析miRNA相對表達(dá)情況，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組受試者miR-21和 miR-206 表達(dá)情況。對UC患者血清miRNA表達(dá)情況與UC臨床特征的進(jìn)行相關(guān)性分析時，以組內(nèi)全部患者血清miR-21及miR-206表達(dá)量的平均值作為截點，高于UC組患者血清miR-21和miR-206表達(dá)量的平均值者判定為高表達(dá)，反之，判定為低表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1兩組受試者miR-21和miR-206表達(dá)情況比較 觀察組miR-21和miR-206的表達(dá)量明顯高于健康對照組(P<0.01)，見表1。

組別例數(shù)miR-21miR-206健康對照組421.11±0.361.21±0.65觀察組 422.32±0.663.33±0.86t值12.41913.508P值<0.001<0.001

健康對照組：健康體檢者；觀察組：潰瘍性結(jié)腸炎患者

2.2UC患者miR-21和miR-206表達(dá)情況與臨床特征的相關(guān)性分析 觀察組患者中血清miR-21低表達(dá)15例，高表達(dá)27例；血清miR-206低表達(dá)11例，高表達(dá)31例。UC患者活動期的血清miR-21及miR-206高表達(dá)率高于緩解期患者(均P<0.05)，不同性別、年齡、病變部位、疾病分級的miR-21和miR-206高表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 UC患者miR-21和miR-206表達(dá)情況與臨床特征的相關(guān)性分析 (例)

UC：潰瘍性結(jié)腸炎；a為校正χ2值

2.3UC患者血清miR-21與miR-206表達(dá)量的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果提示：UC患者血清miR-21表達(dá)量與血清miR-206表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.396，P=0.009)，見圖1。

圖1 42例潰瘍性結(jié)腸炎患者血清miR-21與miR-206表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 討 論

IBD是一種胃腸道特發(fā)性炎性疾病，病因多樣、機制復(fù)雜。雖然有研究表明，遺傳因素、環(huán)境因素和宿主免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用可能在IBD中發(fā)揮重要作用[11-12]，但具體機制尚不十分清楚。

miRNA是一類含19～24個核苷酸的非編碼RNA分子，可通過調(diào)控目標(biāo)基因mRNA的翻譯和穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、分化及血管生成等行為[14]，在腫瘤進(jìn)展、器官纖維化、組織瘢痕愈合等多種疾病和病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。近年來有研究表明miRNA的表達(dá)變化及其調(diào)節(jié)功能同樣參與IBD、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，并在其中扮演重要角色[16-17]。miR-21是較早發(fā)現(xiàn)的miRNA,廣泛存在于多種生物及哺乳動物的多種組織及細(xì)胞中，既往對miR-21的研究多集中于腫瘤方面，大量研究證實miR-21通過下調(diào)多種抑癌基因的表達(dá)發(fā)揮促癌作用[18-20]。然而，近年來miR-21在IBD中的作用越來越受到關(guān)注。Svrcek等[21]研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸黏膜組織中miR-155及miR-21均呈高表達(dá)，且通過抑制巨噬細(xì)胞甘露糖受體發(fā)揮作用。有研究表明，CD及UC患者血清miR-16、miR-21及miR-223表達(dá)水平均顯著高于健康對照，其中miR-16、miR-21及miR-223在CD患者中上調(diào)更為明顯[8]。Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在腸道黏膜炎癥和損傷組織中呈過表達(dá)，而敲除小鼠體內(nèi)miR-21可降低黏膜炎癥反應(yīng)和組織損傷，從而提高葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的致死性結(jié)腸炎的生存率。因此，下調(diào)腸道m(xù)iR-21的表達(dá)可以預(yù)防IBD患者疾病的發(fā)生、發(fā)展。另有體內(nèi)外研究試驗表明，miR-206在UC中的表達(dá)量顯著上調(diào)，通過直接抑制A3腺苷受體表達(dá)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促炎因子的作用[23-24]。以上研究均提示，miR-21及miR-206在UC中呈差異表達(dá)，并可發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者血清miR-21及miR-206的表達(dá)量均明顯高于健康對照組(P<0.01)。

UC為作為結(jié)直腸黏膜慢性非特異性炎癥性疾病，其病變部位、疾病分期及分級等不同臨床特征與患者生活質(zhì)量密切相關(guān)，并嚴(yán)重影響患者預(yù)后。Chen等[25]利用RT-PCR方法分別檢測CD、UC及健康對照者血清miRNA水平，發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比，CD和UC患者的血清miR-146b-5p表達(dá)顯著升高，且其表達(dá)水平與疾病活動性密切相關(guān)，較C反應(yīng)蛋白更具特異性。研究發(fā)現(xiàn)miR-15在UC患者腸黏膜組中呈顯著高表達(dá)，通過激活核因子κB級聯(lián)反應(yīng)抑制A2A腺苷受體蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)UC炎癥及免疫反應(yīng)[26]。活動期UC患者結(jié)腸黏膜中miR-141呈低表達(dá)，并通過抑制CXC趨化因子配體 5及激活蛋白激酶B信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[27]。UC患者應(yīng)用美沙拉嗪治療可下調(diào)腸黏膜組織中miR-206的表達(dá)水平，促使組織炎癥得到控制并使疾病長期維持在緩解期，提示miR-206表達(dá)水平可以作為預(yù)測UC患者對美沙拉嗪治療反應(yīng)性的生物標(biāo)志物[9]。本研究進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，UC患者活動期的血清miR-21及miR-206高表達(dá)率高于緩解期患者(均P<0.05)，即miR-21及miR-206表達(dá)在活動期較緩解期顯著升高，說明miR-21及miR-206表達(dá)水平對UC患者的疾病活動程度具有一定的提示作用。相關(guān)性分析顯示UC患者外周血血清中miR-21與miR-206表達(dá)呈正相關(guān)，即miR-21高表達(dá)時，miR-206亦呈高表達(dá)。

綜上所述，miR-21及miR-206在UC患者外周血血清中呈顯著高表達(dá)，且兩者表達(dá)呈明顯正相關(guān)，而高表達(dá)miR-21及miR-206均提示UC處于疾病活動期，以上結(jié)果提示miR-21及miR-206在UC中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，有望成為預(yù)示疾病進(jìn)展的重要分子標(biāo)志物及臨床治療的潛在新靶點，但具體分子機制仍有待進(jìn)一步深入研究。