趙婉君，張 勇，付琳茹，楊 浩，朱精強(qiáng)

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 a.甲狀腺外科， b.移植免疫研究室/華西-華盛頓線粒體與代謝研究中心，成都 610041；2.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

甲狀腺癌作為內(nèi)分泌最為常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率近年來(lái)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，有研究顯示2008年以來(lái)患病率較1998—2008年翻了2倍[2]。2015年癌癥中心統(tǒng)計(jì)表明甲狀腺癌已成為美國(guó)女性惡性腫瘤的第5位[3]，韓國(guó)女性惡性腫瘤的第1位[4]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)來(lái)源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，作為甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，占比高達(dá)90%[1,5]，PTC患者男女比例為1∶3.69，中位診斷年齡為50歲[6]。PTC作為淺表軟組織腫瘤，具有發(fā)病隱匿、早期無(wú)明顯臨床表現(xiàn)、良惡性識(shí)別難度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移迅速的特點(diǎn)[7]?，F(xiàn)有研究表明，PTC發(fā)生發(fā)展是長(zhǎng)期、多因素、分階段的復(fù)雜過(guò)程，由多基因[如鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1(BRAF)、甲狀腺濾泡細(xì)胞發(fā)生大鼠肉瘤癌基因(RAS)、RET(RET proto-oncogene)、p53等][8]和環(huán)境因素(放射接觸史、碘攝入等)[9-10]共同參與，但具體機(jī)制尚不明確[6]。除此之外，目前篩查主要依靠甲狀腺專(zhuān)科彩色多普勒超聲，診斷金標(biāo)準(zhǔn)為超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢，有創(chuàng)且需要病理專(zhuān)家的配合，基層醫(yī)院難以開(kāi)展[11]。此外，臨床上缺少高敏感性和特異性的分子診斷標(biāo)志物以及識(shí)別復(fù)雜難治病理的關(guān)鍵標(biāo)志物。因此，篩選甲狀腺腫瘤分子標(biāo)志物在術(shù)前判斷甲狀腺腫瘤良惡性以及精細(xì)化區(qū)分PTC的侵襲性亞型也是臨床的迫切需要，將使部分患者避免不必要的外科手術(shù)，提高治愈率。現(xiàn)對(duì)基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)在PTC的診斷、分型和預(yù)后等方面的研究進(jìn)行總結(jié)，為PTC的診療發(fā)展提供新的思路和依據(jù)。

1 基于生物質(zhì)譜技術(shù)的腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)概述

2001年，人類(lèi)基因組測(cè)序計(jì)劃的完成促使科學(xué)家對(duì)人類(lèi)基因組的功能進(jìn)行研究[12-13]。隨著基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的發(fā)展，標(biāo)志著“蛋白質(zhì)組學(xué)”這一全新領(lǐng)域的誕生，其以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，從整體的角度分析細(xì)胞、組織、器官動(dòng)態(tài)變化的蛋白組成和活動(dòng)規(guī)律[14]。蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)是生物質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)測(cè)定質(zhì)荷比進(jìn)行蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)分析，離子化方式主要分為基質(zhì)輔助激光解析電離[15]和電噴霧電離[16]，具有高通量、高靈敏度、低檢測(cè)線、自動(dòng)化等特點(diǎn)[17-18]。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠破譯基因的編碼信息，包括氨基酸序列、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等[19]。2014年，《自然》雜志的一篇文章公布了人類(lèi)蛋白質(zhì)組草圖，全面覆蓋了超過(guò)80%的人類(lèi)預(yù)期蛋白質(zhì)組，還發(fā)現(xiàn)了一些新的蛋白質(zhì)，為人類(lèi)腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)[20]。2019年2月，中國(guó)肝細(xì)胞癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究也取得了突破性成果，提出了基于蛋白質(zhì)組學(xué)的早期肝癌分型以及靶向治療靶點(diǎn)[21]。在基因表達(dá)成蛋白質(zhì)的過(guò)程中，多種影響因素決定腫瘤的表型，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組水平的改變。根據(jù)“中心法則”，蛋白質(zhì)組水平與腫瘤表型關(guān)系最為密切，蛋白質(zhì)表達(dá)量、穩(wěn)定性及修飾的改變等都可能影響蛋白質(zhì)的功能[22]。借助先進(jìn)的生物質(zhì)譜技術(shù)，研究生物體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律，有助于發(fā)現(xiàn)腫瘤早期診療相關(guān)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[23]。腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞由于基因功能表達(dá)以及蛋白質(zhì)組成等方面的不同會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)行為差異，因而通過(guò)比較兩者之間蛋白質(zhì)種類(lèi)、表達(dá)量、修飾狀態(tài)的差異，分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，可能找到與腫瘤診斷、分子分型、精準(zhǔn)治療相關(guān)的高特異度和高靈敏度蛋白質(zhì)標(biāo)志物，揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。Zhang等[24]對(duì)95例結(jié)直腸癌樣本進(jìn)行基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并基于蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果將其分成了5種亞型，并第一次綜合分析了人類(lèi)癌癥的“蛋白組-基因組學(xué)”特征，推動(dòng)了結(jié)直腸癌診斷和治療的發(fā)展。Mertins等[25]對(duì)105例乳腺癌樣本進(jìn)行基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)和磷酸化修飾分析，展現(xiàn)了基于質(zhì)譜的高通量蛋白質(zhì)組技術(shù)在癌癥分子分型中的能力。Zhang等[26]對(duì)169例高級(jí)別漿液性腺癌的卵巢癌樣本進(jìn)行了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分析，鑒定到一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)，與基因組數(shù)據(jù)整合對(duì)該疾病提出了一些新的見(jiàn)解。Ge等[27]對(duì)84例彌漫性胃癌樣本進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并根據(jù)蛋白質(zhì)組結(jié)果將其分成3個(gè)亞型，揭示了一些潛在的治療靶點(diǎn)?？傊谏镔|(zhì)譜的腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)展示出越來(lái)越強(qiáng)的能力，為理解腫瘤生物學(xué)提供了新思路，并推動(dòng)腫瘤診療向精準(zhǔn)醫(yī)療方向發(fā)展。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在PTC領(lǐng)域研究的突破口

研究表明,PTC的生物學(xué)行為差異較大，有終生無(wú)變化的微小癌，也有血管侵襲、血性播散至肺、肝、骨和腦等高死亡特性的腫瘤，但是造成這種差異的機(jī)制不明[28-30]?，F(xiàn)有關(guān)PTC發(fā)生、發(fā)展的研究多集中于基因?qū)用妫蠖鄶?shù)典型PTC與鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1 V600E的突變具有顯著相關(guān)性[31]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)PTC與大鼠肉瘤癌基因、RET、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因、p53等有直接或間接的關(guān)系[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)微RNA(microRNA，miRNA)，如miR-146、miR-221、miR-222、miR-155、miR-181等的上調(diào)對(duì)PTC的發(fā)生發(fā)展有重要作用[20]。但基因突變、mRNA的改變與最終蛋白表達(dá)的功能實(shí)現(xiàn)有顯著差異。因此，針對(duì)蛋白質(zhì)功能實(shí)現(xiàn)的靶向篩選還有很大的研究空間。如何通過(guò)分子層面找到PTC的關(guān)鍵靶點(diǎn)，是病因探索的方向，同時(shí)也是尋找靶向藥物的前提和基礎(chǔ)。對(duì)于雌激素、碘攝入、橋本甲狀腺炎等因素對(duì)PTC發(fā)生發(fā)展影響作用的研究?jī)H停留在發(fā)現(xiàn)臨床現(xiàn)象層面，并未深入明確其相互影響的作用機(jī)制，這也是臨床較為關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

早期診斷對(duì)PTC至關(guān)重要，細(xì)針針吸細(xì)胞學(xué)是目前診斷PTC最行之有效的方法。然而，其對(duì)病理科醫(yī)師的專(zhuān)業(yè)經(jīng)驗(yàn)及能力要求較高，即使是從業(yè)10年的病理科醫(yī)師也仍有15%～30%無(wú)法明確診斷[20]。無(wú)法判斷的病理表現(xiàn)為濾泡上皮細(xì)胞的不典型增生和細(xì)胞特點(diǎn)的不典型性，人工難以鑒別。同時(shí)，細(xì)針針吸細(xì)胞學(xué)本身為有創(chuàng)操作，患者接受度不高，作為一種檢查手段對(duì)患者身心影響較大。因此，尋找體液內(nèi)(血液、尿液等)更為敏感可靠的腫瘤標(biāo)志物以提高診斷效能，對(duì)于PTC的早期檢測(cè)、更好的分類(lèi)和最佳治療極為必要。關(guān)于PTC亞型的分類(lèi)國(guó)內(nèi)目前開(kāi)展較少，主要原因是專(zhuān)科病理診斷能力不足，但精準(zhǔn)的亞型分型(如高細(xì)胞亞型等)識(shí)別有助于臨床鑒別生物行為不良的PTC，盡早干預(yù)，提高患者預(yù)后。因此，尋找到更為精準(zhǔn)地區(qū)分PTC生物學(xué)行為的關(guān)鍵標(biāo)志物，找到PTC腺內(nèi)播散、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的關(guān)鍵靶點(diǎn)，以它們作為新的分型標(biāo)準(zhǔn)將更好地指導(dǎo)PTC的臨床決策。

目前國(guó)際上針對(duì)PTC手術(shù)策略的爭(zhēng)論點(diǎn)在于手術(shù)方式及手術(shù)范圍的選擇[33-34]。PTC初始治療的主要目標(biāo)是降低癌癥死亡率，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)提高整體或疾病特異生存率?，F(xiàn)階段針對(duì)低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(美國(guó)癌癥聯(lián)合委員分期)、微小癌(癌灶直徑<1 cm)是否過(guò)度治療的討論成為熱點(diǎn)。同時(shí)針對(duì)術(shù)前評(píng)估僅為孤立癌灶的患者是否進(jìn)行全切和側(cè)葉切除，以及是否進(jìn)行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃也存在爭(zhēng)議。甲狀腺全切或預(yù)防性淋巴結(jié)清掃的支持者認(rèn)為無(wú)論是在甲狀腺本身還是在局部淋巴結(jié)中，隱匿性疾病的高發(fā)均是PTC的顯著特點(diǎn)，徹底的手術(shù)方式可以降低疾病復(fù)發(fā)率，減少再次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)[35]。全切后可以加做131I放射輔助治療，提高患者無(wú)病生存率[36]。同時(shí)，甲狀腺全切后加做131I放射輔助治療可以使血清甲狀腺球蛋白成為術(shù)后復(fù)發(fā)的敏感標(biāo)志物，提高監(jiān)測(cè)準(zhǔn)確性[36]。但其意味著更高的手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率(喉返神經(jīng)損傷及甲狀旁腺功能減退等)和終生激素替代治療[20]。上述問(wèn)題的本質(zhì)在于現(xiàn)有的PTC分期分型精準(zhǔn)度對(duì)手術(shù)方式選擇指導(dǎo)的適用度不夠。如果能夠通過(guò)現(xiàn)有的技術(shù)，將目前認(rèn)為微小癌或低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)PTC中的生物學(xué)行為不良的類(lèi)型加以識(shí)別，精準(zhǔn)化手術(shù)策略的選擇，將手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及手術(shù)效果維持在適度的平衡狀態(tài)會(huì)大大提升患者術(shù)后的生存質(zhì)量及預(yù)后。

131I是治療術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(廣泛肺轉(zhuǎn)移)的主要武器，但是轉(zhuǎn)移灶的131I攝取能力是良好治療效果的前提。在臨床實(shí)踐中，約有30%伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的PTC患者轉(zhuǎn)移灶顯示出去分化特性，從而碘耐受[20]。目前針對(duì)碘耐受伴廣泛肺轉(zhuǎn)移的患者并無(wú)有效的治療手段，大劑量131I的使用反而給患者帶來(lái)不必要的并發(fā)癥，影響生活質(zhì)量。與此同時(shí)，PTC去分化機(jī)制尚不明確。因此，如何早期識(shí)別碘耐受患者或?qū)ふ襊TC去分化的關(guān)建作用點(diǎn)是突破碘耐受PTC治療的首要前提。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在PTC研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法主要包括收集樣本、提取蛋白、將蛋白酶切成肽段、肽段分級(jí)、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)處理、生物信息學(xué)分析等步驟。而每個(gè)步驟都存在一些挑戰(zhàn)，需根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化和應(yīng)對(duì)。目前PTC的相關(guān)研究較少，對(duì)于其體液和組織的研究仍存在一些挑戰(zhàn)，如對(duì)于PTC血漿或血清蛋白質(zhì)組的研究主要在于高峰度蛋白的存在，蛋白質(zhì)濃度動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)12個(gè)數(shù)量級(jí)，蛋白質(zhì)種類(lèi)復(fù)雜，存在大量蛋白質(zhì)變體等[37]。

3.1PTC蛋白質(zhì)組學(xué)研究 Wilhelm等[20]發(fā)表的基于生物質(zhì)譜人類(lèi)蛋白質(zhì)組草圖中，在正常人甲狀腺中鑒定出2 791個(gè)蛋白質(zhì)，為甲狀腺癌中蛋白質(zhì)組變化提供了參考。而PTC蛋白質(zhì)組研究仍然有限，原因包括早期生物質(zhì)譜技術(shù)以及臨床樣品獲取等方面的限制，以及PTC作為治愈率最高的癌癥受到研究者的重視度不夠。Sofiadis等[38]對(duì)PTC和甲狀腺濾泡狀癌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了表征，采用二維凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了25個(gè)差異蛋白點(diǎn)，如膜聯(lián)蛋白A5，但是該方法通量低，準(zhǔn)確度不高。Ban等[39]利用質(zhì)譜技術(shù)從PTC組織和匹配的正常組織中分別鑒定到524種和432種蛋白質(zhì)，其中145種蛋白質(zhì)在癌組織中特異表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)腎連蛋白和malectin 蛋白可能作為PTC的特征生物標(biāo)志物，在正常與癌組織區(qū)分方面展示出蛋白質(zhì)組優(yōu)于基因組的能力。陳國(guó)群和周亞?wèn)|[40]探討了甲狀腺包裹性濾泡型乳頭狀癌與普通型乳頭狀癌的蛋白組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，有助于甲狀腺包裹性濾泡型乳頭狀癌的早期診斷。在PTC的組織樣本中，人們還發(fā)現(xiàn)半乳凝集素3、S100-A6蛋白、組織蛋白酶B、角蛋白19等可作為PTC的良好標(biāo)志物[41-42]。目前，PTC蛋白質(zhì)組覆蓋度還不深，研究對(duì)象還不全面，目前發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的差異蛋白質(zhì)組還不豐富，缺少高靈敏性和高特異性的生物標(biāo)志物?？傊?，對(duì)PTC蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行深度解析，還需要臨床工作者和基礎(chǔ)研究人員共同努力和協(xié)作，建立PTC組織、細(xì)針穿刺液、血清、尿液蛋白質(zhì)組診斷模型，用于PTC早期診斷、術(shù)前判斷、分期分級(jí)、精準(zhǔn)治療、預(yù)后判斷等[43-44]。

3.2PTC糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究 糖蛋白質(zhì)組是蛋白質(zhì)組的一個(gè)分支。糖基化是蛋白質(zhì)最廣泛、最復(fù)雜的翻譯后修飾之一，廣泛參與細(xì)胞識(shí)別、黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊、功能定位、胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)仁株P(guān)鍵，其異常表達(dá)與腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[45]。糖基化根據(jù)其連接氨基酸的不同主要分為N-糖基化和O-糖基化兩大類(lèi)，糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，糖基化的微觀不均一，糖基化修飾豐度低，在質(zhì)譜分析前往往需要先富集糖鏈或糖肽，并需要通過(guò)專(zhuān)業(yè)的軟件進(jìn)行分析[46]。目前美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的腫瘤蛋白質(zhì)標(biāo)志物中1/3以上是糖基化修飾蛋白，如肝癌的診斷標(biāo)志物甲胎蛋白[47]，因而研究PTC糖蛋白質(zhì)組有助于發(fā)現(xiàn)新型標(biāo)志物，幫助人們深入理解其發(fā)病機(jī)制。

甲狀腺作為內(nèi)分泌器官對(duì)于代謝調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，其腺體內(nèi)含有大量的糖蛋白，包括甲狀腺球蛋白、甲狀腺過(guò)氧化物酶、促甲狀腺激素、促甲狀腺激素受體等。一旦該器官發(fā)生癌變，其糖基化修飾也會(huì)異常變化，包括唾液酸化、巖藻糖基化、糖型分枝情況等[48]。研究者觀察到甲狀腺癌中甲狀腺球蛋白的唾液酸化程度下降[49]，核心巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8蛋白的表達(dá)量升高與PTC腫瘤大小與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[48,50]。但是目前關(guān)于PTC的糖蛋白質(zhì)組研究較少，人們對(duì)其含有的糖蛋白質(zhì)種類(lèi)變化、表達(dá)量變化、糖基化結(jié)構(gòu)變化、糖基化位點(diǎn)變化、糖基化修飾變化等情況還不了解，需要先進(jìn)的分析方法和技術(shù)進(jìn)行闡明。

4 小 結(jié)

目前關(guān)于PTC的發(fā)病機(jī)制、診斷精準(zhǔn)度、治療策略等方面的研究中還有很多問(wèn)題未解決，這也是將基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于PTC研究的切入點(diǎn)。盡管基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)目前在乳頭狀甲狀腺癌研究中還存在很多困難和挑戰(zhàn)，但是隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步、蛋白質(zhì)組學(xué)方法的成熟，越來(lái)越多的研究者將目光聚焦到甲狀腺癌血漿、尿液等生物樣本中。通過(guò)創(chuàng)新的方法和策略篩選可應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)診斷、分型以及預(yù)后的分子標(biāo)志物，包括差異表達(dá)的蛋白質(zhì)、糖基化修飾等，并為研究癌癥發(fā)病機(jī)制提供新的證據(jù)，為開(kāi)發(fā)生物治療藥物提供新的治療靶點(diǎn)和思路。