王定康， 張 敏， 黃 鈞， 金 垚， 周榮清， 吳重德

(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院/皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)廣泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品如豆瓣、醬油等生產(chǎn)過(guò)程中，在產(chǎn)品產(chǎn)醇、產(chǎn)香、增鮮等方面具有重要作用[1-2]。在食品發(fā)酵過(guò)程中，魯氏酵母菌可以產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，如異戊醇、異丁醇、活性戊醇等重要的芳香雜醇類物質(zhì)，以提高食品品質(zhì)[3]。然而，在發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程中，魯氏酵母菌經(jīng)常受到多種環(huán)境脅迫，包括鹽脅迫、酸性脅迫和酒精脅迫等，特別是鹽脅迫引起的滲透脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理的損傷[4]；同時(shí)鹽脅迫也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的形成，從而影響胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的變化，而維持氧化還原穩(wěn)態(tài)被認(rèn)為是細(xì)胞耐鹽性能的重要因素之一[5]。研究表明，細(xì)胞會(huì)采取一些策略來(lái)抵御鹽脅迫，比如調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境、細(xì)胞膜和細(xì)胞代謝等[6]。He等[7]研究了嗜鹽四鏈球菌鹽脅迫耐受機(jī)制，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫使細(xì)胞內(nèi)脯氨酸、甘氨酸甜菜堿和海藻糖含量升高。Sara等[8]通過(guò)補(bǔ)充油酸和麥角固醇，發(fā)現(xiàn)可以降低釀酒酵母胞內(nèi)活性氧的含量，從而降低對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷。谷胱甘肽(GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，在生物系統(tǒng)中具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、細(xì)胞解毒活性和營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)等作用[9]。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GSH可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能，提高舊金山乳桿菌的抗冷凍脅迫性能。

近些年，對(duì)魯氏酵母菌耐鹽機(jī)制尚未充分研究，為發(fā)揮食品微生物魯氏酵母菌的生理功能和提高其生物制造效率，有必要深入認(rèn)識(shí)魯氏酵母菌鹽脅迫耐受的生理機(jī)制。本文擬研究鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌生理特性的影響，希望為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)魯氏酵母菌的耐鹽機(jī)制，提升其鹽脅迫抗性，強(qiáng)化其發(fā)酵生產(chǎn)性能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii)，由本實(shí)驗(yàn)室從百年老字號(hào)釀造企業(yè)的醬醪中分離，經(jīng)26S rDNA和ITS區(qū)域序列測(cè)序、鑒定、命名，并保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 3791。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

HEPES-K細(xì)胞裂解液，購(gòu)自雷根生物公司；BCECF AM熒光探針，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；過(guò)氧化氫酶CAT測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶SOD測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化物酶POD測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-PX測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠；92-IIN 型超聲波破碎粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2G型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；JJ500型分析天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；F-7100型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)基及鹽脅迫實(shí)驗(yàn)

YPD培養(yǎng)基：10 g/L酵母膏，20 g/L蛋白胨，20 g/L 葡萄糖，pH值為6.0。

從甘油管中將菌種Z.rouxii以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種于新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，至對(duì)數(shù)中期獲得種子液。將體積分?jǐn)?shù)為5%的種子液接種于不同NaCl質(zhì)量濃度(0、60、120 g/L)的新鮮YPD培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)36 h，至對(duì)數(shù)中后期，進(jìn)行后續(xù)生理數(shù)據(jù)測(cè)定分析。

1.3.2魯氏酵母菌生物量和乙醇含量測(cè)定

菌體生物量的測(cè)定：取不同鹽濃度下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期的細(xì)胞，10 000g離心5 min，用蒸餾水洗菌兩次，105 ℃烘干2 h，測(cè)定干細(xì)胞重量。

乙醇含量測(cè)定：參考文獻(xiàn)[11]所述的方法與步驟。

1.3.3胞內(nèi)pH值測(cè)定

參考文獻(xiàn)[12]所述的方法，取5 mL 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期的細(xì)胞, 10 000g離心5 min，用50 mmol/L HEPES-K (pH值8.0)緩沖液洗滌2次，重懸于等體積的相同緩沖液，加入1 μL BCECF AM，30 ℃溫水浴20 min。用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)洗滌3次后重懸于等體積的該緩沖液中。根據(jù)文獻(xiàn)[13-14]所述方法用熒光分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液熒光強(qiáng)度(Itotal)和上清液熒光強(qiáng)度(Ifiltrate)，其中激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm和440 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm，狹縫寬度均為5 nm。熒光強(qiáng)度計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

I=[(I490)total-(I490)flitrate]/[(I440)total-(I440)flitrate]，

(1)

再根據(jù)lgI的值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胞內(nèi)pH值。

1.3.4胞內(nèi)活性氧水平及抗氧化酶系活力測(cè)定

取5 mL 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期的細(xì)胞, 10 000g離心5 min，收集菌體，用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)洗滌3次，重懸于等體積的該緩沖液中。將樣品用超聲細(xì)胞破碎儀破碎，破碎條件參照文獻(xiàn)[15]的方法，破碎后10 000g離心5 min，取上清液。采用南京建成生物公司的活性氧(ROS)試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ROS含量，并用相關(guān)抗氧化酶試劑盒測(cè)定抗氧化酶酶活力，具體操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光值。

1.3.5胞內(nèi)GSH含量測(cè)定

細(xì)胞提取和破碎方法同1.3.4，采用南京建成生物公司的還原型GSH試劑盒測(cè)定胞內(nèi)GSH含量，具體操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

論文數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。采用軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以 One-way ANOVA 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并采用軟件Origin 8.5對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)和代謝的影響

考察了不同鹽濃度脅迫對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)和代謝的影響，結(jié)果如圖1。魯氏酵母菌在無(wú)鹽培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)性能良好，細(xì)胞干重可達(dá)1.2 mg/mL。隨著鹽質(zhì)量濃度增加至120 g/L，生物量逐漸下降，細(xì)胞干重降到0.81 mg/mL，表明鹽脅迫會(huì)對(duì)魯氏酵母菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，但該菌具有一定的耐鹽性能。然而，隨著鹽質(zhì)量濃度從0增加到120 g/L，發(fā)酵液中單位(每克)菌體的乙醇含量卻逐漸升高，從11.64 mg增加到19.20 mg，這說(shuō)明鹽脅迫下魯氏酵母菌單位菌體的乙醇含量增加，可能與鹽脅迫后生成乙醇的代謝通量增強(qiáng)有關(guān)。李明達(dá)等[16]的研究也表明，鹽脅迫下釀酒酵母合成乙醇代謝途徑的碳流量增加了23.32%，可能是因?yàn)檩^高的鹽濃度抑制了酵母的有氧呼吸作用，增加了厭氧發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的通量，這與本研究中120 g/L鹽質(zhì)量濃度下乙醇含量顯著增加的結(jié)果一致。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。圖1 鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌細(xì)胞干重和乙醇含量的影響Fig.1 Changes of biomass and ethanol content in Z. rouxii under salt stress

2.2 鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)pH值的影響

測(cè)定了魯氏酵母菌鹽脅迫后胞內(nèi)pH水平的變化情況，見(jiàn)圖2。圖2顯示，魯氏酵母菌胞內(nèi)pH值隨著鹽濃度的增加而降低，在120 g/L鹽質(zhì)量濃度下較為顯著。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞胞內(nèi)pH值與細(xì)胞生長(zhǎng)活力有關(guān)，pH值的減小伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)活力減弱[17]，細(xì)胞在120 g/L鹽質(zhì)量濃度下，胞內(nèi)pH值降低與其生長(zhǎng)性能降低的結(jié)果相一致。趙春燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌在酸脅迫條件下，胞內(nèi)pH值水平降低，其生長(zhǎng)也受到一定抑制。張娟[18]報(bào)道了冷凍脅迫會(huì)導(dǎo)致舊金山乳桿菌胞內(nèi)pH水平降低，發(fā)現(xiàn)GSH能顯著改善冷凍脅迫造成的胞內(nèi)pH值的下降。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。圖2 魯氏酵母菌鹽脅迫下胞內(nèi)pH水平變化Fig.2 Changes of intracellular pH in Z. rouxii under salt stress

2.3 鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)活性氧水平和抗氧化酶系活力的影響

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是生物體中主要的氧自由基的統(tǒng)稱，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、脂氧自由基、二氧化氮和一氧化氮自由基，并且高濃度的活性氧簇對(duì)細(xì)胞機(jī)體有毒害作用[19]。本研究考察了鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)活性氧ROS水平的影響(圖3)，結(jié)果表明，隨著鹽脅迫濃度增加，胞內(nèi)活性氧ROS水平急劇增加，特別是在高鹽濃度(120 g/L)時(shí)最為明顯，比NaCl濃度為0時(shí)提高了21倍。說(shuō)明高鹽環(huán)境會(huì)同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)氧脅迫，從而對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷[20]。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。圖3 魯氏酵母菌鹽脅迫下胞內(nèi)ROS水平變化Fig.3 Changes of intracellular ROS level in Z. rouxii under salt stress

微生物細(xì)胞自身具有抵御ROS損傷的能力，如過(guò)量表達(dá)抗氧化酶系，包括過(guò)氧化氫酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)，以及GSH過(guò)氧化物酶(GSH-PX)；此外，還有低分子量的抗氧化劑如GSH等都可以幫助機(jī)體抵御氧化損傷[21]。本研究考察了鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌抗氧化酶系活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。測(cè)定了CAT、SOD、POD以及GSH-PX的活性，研究結(jié)果表明，魯氏酵母菌的抗氧化酶系的活力在鹽脅迫后均有顯著性提高，在60 g/L NaCl時(shí)，POD酶活力提高，比未經(jīng)鹽脅迫的活性提高了1.8倍；繼續(xù)提高鹽質(zhì)量濃度至120 g/L，酶活性略有降低。可能是細(xì)胞機(jī)體為了分解體內(nèi)的活性氧，提高了抗氧化酶系的活力，這可能是Z.rouxii具有較高耐鹽性能的原因之一[22]。Farhangi-Abriz等[23]報(bào)道了鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧的過(guò)量產(chǎn)生，破壞細(xì)胞膜，而細(xì)胞的抗氧化酶系活性的提高在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。此外，Jakubowski等[24]研究發(fā)現(xiàn)，隨著酵母菌中抗氧化物質(zhì)含量增加，比如超氧化物歧化酶SOD的活力增加等，酵母菌在進(jìn)入穩(wěn)定期后會(huì)對(duì)氧化損傷的增強(qiáng)做出適應(yīng)性反應(yīng)。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。圖4 鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響Fig.4 Effects of salt stress on intracellular antioxidant enzymes activity in Z. rouxii

2.4 鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌胞內(nèi)GSH含量的影響

GSH有助于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[25]。本研究考察了鹽脅迫后魯氏酵母菌細(xì)胞內(nèi)GSH含量變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5顯示，鹽脅迫后魯氏酵母菌胞內(nèi)GSH的含量逐漸增加，在120 g/L鹽質(zhì)量濃度時(shí)，GSH含量顯著增加，與無(wú)鹽條件相比增加了73.4%，有助于魯氏酵母菌維持胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，并通過(guò)酶促反應(yīng)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而抵御鹽脅迫[26]。相似的結(jié)果在對(duì)熱帶假絲酵母的研究中也有報(bào)道，Ilyas等[27]發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母菌在重金屬離子脅迫條件下，胞內(nèi)GSH的含量顯著高于非脅迫狀態(tài)下的，而氧化應(yīng)激引起的GSH積累的增加可能是細(xì)胞存活的一個(gè)重要因素。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。圖5 魯氏酵母菌鹽脅迫下胞內(nèi)GSH含量變化Fig.5 Changes of intracellular glutathione content in Z. rouxii under salt stress

2.5 添加GSH對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)性能的影響

為了進(jìn)一步研究GSH對(duì)魯氏酵母菌耐鹽性能的影響，考察了不同鹽濃度下外源添加GSH對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果如圖6。圖6顯示，在低鹽條件下，添加0.5 g/L GSH的魯氏酵母菌與未添加相比，生物量無(wú)顯著區(qū)別。隨著鹽濃度的提高，在120 g/L NaCl質(zhì)量濃度條件下，添加0.5 g/L GSH使得魯氏酵母菌的生物量提高了15%。這說(shuō)明，添加GSH能夠提高魯氏酵母菌鹽脅迫下的生長(zhǎng)性能。相似的結(jié)果在其他微生物研究中也有報(bào)道，Zhang等[4]研究了乳酸乳球菌的耐鹽性能，發(fā)現(xiàn)在5 mol/L鹽濃度下，含GSH的乳酸乳球菌細(xì)胞存活率顯著高于對(duì)照組細(xì)胞。Lee等[28]研究發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌在添加GSH的低pH值培養(yǎng)基中，比對(duì)照組生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)性能更強(qiáng)。

*表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。圖6 外源添加GSH對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)性能的影響Fig.6 Effect of exogenous glutathione addition on growth of Z. rouxii under salt stress

3 結(jié) 論

研究了鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌(ZygosaccharomycesrouxiiCGMCC 3791)細(xì)胞生理特性的影響。分別考察了鹽脅迫對(duì)魯氏酵母菌生長(zhǎng)代謝以及胞內(nèi)微環(huán)境(胞內(nèi)pH值、胞內(nèi)活性氧和抗氧化酶系水平等)的影響。研究結(jié)果表明，鹽脅迫抑制了魯氏酵母菌生長(zhǎng)，提高了單位菌體的乙醇含量；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫導(dǎo)致胞內(nèi)pH水平降低，胞內(nèi)活性氧水平和抗氧化酶系活力和胞內(nèi)GSH含量均顯著升高，從而可幫助細(xì)胞抵御鹽脅迫及鹽脅迫引起的氧脅迫。此外，通過(guò)外源添加GSH，使魯氏酵母菌在120 g/L鹽質(zhì)量濃度下生物量提高了15%。本研究結(jié)果有助于了解魯氏酵母菌鹽脅迫條件下的生理特性及鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制，可為進(jìn)一步提高魯氏酵母菌的耐鹽性能，提升其食品微生物制作的效率提供理論基礎(chǔ)。