劉同方， 于燕波， 李淑娟， 沈起兵， 張國(guó)文， 李亦凡， 陳 斌

(深圳市綠航星際太空科技研究院， 廣東 深圳 518117)

隨著對(duì)糖尿病基礎(chǔ)研究的深入，越來越多的治療藥物研制成功并投入臨床使用。西藥降血糖作用明顯、起效快，但往往缺乏整體的協(xié)調(diào)性，具有明顯的副作用，不利于糖尿病患者長(zhǎng)期使用[1]。近年來，諸多研究表明中藥對(duì)糖尿病具有多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的綜合治療作用，且中藥治療疾病的毒副作用較小[2-4]。所以，從天然的植物中尋找降血糖的有效成分是開發(fā)治療糖尿病食品的一條重要的途徑。已有研究表明，白子菜[5]、苦瓜[6]、青錢柳[7]、桑葉[8]、甜茶葉[9]、玉竹[10]、葡萄皮[11]、枇杷葉[12]等植物中的活性成分具有降低血糖和促進(jìn)胰島素分泌等作用。本研究主要通過對(duì)植物提取物進(jìn)行篩選，并進(jìn)行配方優(yōu)化，最后進(jìn)行體外降血糖功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，以期為研制具有輔助降血糖功能的配方提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(MTT cell proliferation and cytotoxicity assay kit)，美國(guó)Amrecso公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美國(guó)Sigma公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)，上海晶純生化科技股份有限公司；α-葡萄糖苷酶(酵母源)，美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司；MEM低糖培養(yǎng)基及胰蛋白酶(含0.25%乙二胺四乙酸)，美國(guó)Gibco公司；地特胰島素，丹麥諾和諾德公司；HepG2細(xì)胞株購于北京協(xié)和醫(yī)院；葡萄糖測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、葡萄糖等均為分析純，購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；提取物原料為固體粉末狀，由張家界至誠生物有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8B型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；BCL-1000A型超凈工作臺(tái)，北京亞太科隆公司；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)SANYO儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測(cè)定

取10 mL試管，依次加入pH=6.8磷酸緩沖液1.85 mL，0.40 U/mL酶溶液100 μL，加入100 μL樣品溶液，渦旋振蕩混合均勻，37 ℃恒溫水浴15 min，再加入0.011 6 mol/LpNPG溶液50 μL，渦旋振蕩混合均勻，37 ℃恒溫水浴20 min，再加入8.00 mL 0.20 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，405 nm處測(cè)定吸光度值，α-葡萄苷酶活性抑制率計(jì)算見式(1)。

(1)

式(1)中，E抑制率為α-葡萄苷酶活性抑制率，A空白為不加樣品反應(yīng)后的吸光度值，A樣品為加入樣品反應(yīng)后的吸光度，A背景為只加樣品的吸光度值，設(shè)阿卡波糖片為陽性對(duì)照組，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值，計(jì)算抑制率。

1.3.2不同提取物原料體外酶抑制率活性比較

通過對(duì)不同濃度桑葉提取物、苦瓜提取物、葡萄皮提取物、甜茶葉提取物、白子菜提取物、玉竹提取物、青錢柳葉提取物和枇杷葉提取物等8種植物提取物原料(見表1)進(jìn)行體外酶抑制率活性比較，篩選出活性較強(qiáng)的普通食品、新食品或藥食同源原料提取物進(jìn)行配方優(yōu)化設(shè)計(jì)。

表1 用于降血糖配方設(shè)計(jì)的8種植物提取物

1.3.3配方優(yōu)化設(shè)計(jì)

通過不同原料活性比較實(shí)驗(yàn)，選取活性高于陽性對(duì)照組的提取物原料，采用Design Expert 8.0.6中D-optimal限制成分上下界的方法，對(duì)組分用量范圍進(jìn)行人為限制，然后通過對(duì)回歸方程及各組分等高線圖和響應(yīng)曲面的分析，確定最優(yōu)配方。

1.3.4HepG2細(xì)胞體外模型降血糖效果評(píng)價(jià)

1.3.4.1 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型建立

參考文獻(xiàn)[13]方法建立體外細(xì)胞模型，HepG2細(xì)胞1×105個(gè)/mL接入細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入終濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h，再加入終濃度為1×10-7mmol/L的胰島素刺激10 min，即建立高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型。

1.3.4.2 細(xì)胞存活率的測(cè)定

采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率[14]，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至可傳代后用胰蛋白酶溶液消化，用MEM低糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接入96孔板，每孔180 μL。貼壁生長(zhǎng)24 h后向細(xì)胞中加入20 μL待測(cè)樣品，同時(shí)設(shè)添加20 μL 磷酸鹽緩沖液的細(xì)胞孔作為空白對(duì)照組，做6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。孵育24 h后添加20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后吸盡培養(yǎng)基并添加150 μL DMSO，室溫放置10 min后于570 nm處測(cè)定吸光度值。將空白組細(xì)胞存活率設(shè)置為100%，細(xì)胞存活率計(jì)算見式(2)。

(2)

式(2)中，γ細(xì)胞存活率為細(xì)胞存活率，A實(shí)驗(yàn)組為添加待測(cè)樣品處理后測(cè)得吸光度值，A空白組為添加磷酸鹽緩沖液處理后測(cè)得吸光度值。

1.3.4.3 葡萄糖利用率的測(cè)定

根據(jù)葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法[15]測(cè)定葡萄糖含量，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞同時(shí)添加葡萄糖溶液和樣品溶液，模型對(duì)照組添加葡萄糖溶液和等體積磷酸鹽緩沖液，空白組僅添加等體積無菌磷酸鹽緩沖液，添加葡萄糖終濃度為30 mmol/L，繼續(xù)孵育24 h，添加胰島素(終濃度為1×10-7mmol/L)刺激細(xì)胞10 min，隨后立即吸取上層培養(yǎng)基，用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定葡萄糖濃度，葡萄糖利用率計(jì)算見式(3)。

(3)

式(3)中，c1為原培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，5.55 mmol/L，c2為葡萄糖添加終濃度，0或30 mmol/L，c3為上層培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，mmol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物對(duì)α-葡萄苷酶抑制活性比較結(jié)果分析

不同提取物原料對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取物原料對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較Fig.1 Comparison of inhibitory activities of different extracts on α-glucosidase

由圖1可知，在相同質(zhì)量濃度條件下，桑葉提取物、葡萄皮提取物、青錢柳葉提取物和枇杷葉提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率均大于陽性對(duì)照組，因此選取以上4種提取物進(jìn)行配方優(yōu)化設(shè)計(jì)。

2.2 配方優(yōu)化設(shè)計(jì)結(jié)果分析

2.2.1混料設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，得到實(shí)驗(yàn)方案，并按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立回歸方程：

E抑制率=41.11A+44.25B+42.13C+35.58D-
26.63AB+17.66AC+33.36AD+17.97BC+
4.27BD+8.92CD-68.89ABC+176.71ABD-
63.09ACD+24.21BCD。

其中A、B、C、D分別表示枇杷葉提取物、青錢柳葉提取物、葡萄皮提取物、桑葉提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由回歸方程和方差分析可見，擬合的三次方程中ABD和BCD三次項(xiàng)的系數(shù)為正值，說明枇杷葉提取物、青錢柳提取物、葡萄皮提取物和桑葉提取物對(duì)體外抑制率起到貢獻(xiàn)作用，二次項(xiàng)回歸系數(shù)AD項(xiàng)絕對(duì)值最大，說明在混料配方中枇杷葉提取物和桑葉提取物復(fù)配液對(duì)α-葡萄糖苷酶的體外抑制率的貢獻(xiàn)最大。

表2 混料設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.2.2較佳復(fù)配比例的確定與驗(yàn)證

當(dāng)葡萄皮提取物添加比例固定在10.00%時(shí)，不同比例枇杷葉提取物、青錢柳提取物和桑葉提取物溶液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的等高線圖及3D響應(yīng)面圖見圖2。其中響應(yīng)面圖為曲面，表明因素之間存在交互作用。通過軟件優(yōu)化功能，對(duì)最優(yōu)配方進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)配方條件下的結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖3。

通過數(shù)據(jù)分析，確定較佳復(fù)配比例為：枇杷葉提取物41.82%，青錢柳提取物26.05%，葡萄皮提取物10.00%，桑葉提取物22.13%，體外抑制率的預(yù)測(cè)值為 48.73%。按照最優(yōu)的復(fù)配比例進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果，得到配方溶液對(duì)α-葡萄糖苷酶的體外抑制率為49.32%±0.15%，與響應(yīng)面的預(yù)測(cè)值無明顯差異，說明響應(yīng)面模型優(yōu)化復(fù)配4種提取物的最佳復(fù)配比例的結(jié)果可靠。

2.3 HepG2細(xì)胞體外模型降血糖效果分析

2.3.1配方對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

圖2 不同比例提取物溶液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響Fig.2 Effects of different proportions of extract solutions on inhibitory rate of α-glucosidase

圖3 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)較優(yōu)配方比例的預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of proportion of better formular by data processing software

采用MTT法測(cè)定了配方樣品對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響，數(shù)據(jù)采用Duncan’s multiple range test方法分析，不同字母表示顯著性差異，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，配方樣品在質(zhì)量濃度0.125～0.500 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞存活率均沒有顯著影響，說明配方樣品在質(zhì)量濃度0.500 mg/mL及以下時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。因此，選定此濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

字母代表差異性。圖4 不同濃度配方樣品對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of different concentrations formula sample on cytoactive of HepG2 cells

2.3.2配方樣品對(duì)高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響

當(dāng)加入高濃度葡萄糖刺激后，與空白對(duì)照組相比模型組的葡萄糖利用率顯著降低，說明成功建立了胰島素抵抗模型。采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定配方樣品對(duì)高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響，結(jié)果見圖5。而在添加高濃度葡萄糖刺激的同時(shí)，加入不同濃度配方樣品處理，其中實(shí)驗(yàn)組1添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.125 mg/mL樣品溶液，實(shí)驗(yàn)組2添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.250 mg/mL樣品溶液，實(shí)驗(yàn)組3添加了30 mmol/L葡萄糖溶液和0.500 mg/mL樣品溶液。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組顯著提高胰島素抵抗模型的葡萄糖利用率，且促進(jìn)作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)。當(dāng)樣品終質(zhì)量濃度為0.500 mg/mL時(shí)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率最高，與模型組相比提高了37.88%。結(jié)果表明配方樣品對(duì)高濃度葡萄糖刺激HepG2細(xì)胞造成的胰島素抵抗具有一定的改善作用。

不同字母代表差異顯著。圖5 配方樣品對(duì)高糖誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響Fig.5 Effects of formula samples on glucose utilization in HepG2 cells induced by elevated glucose

2.3.3配方對(duì)高糖和高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響

不同字母代表差異顯著。圖6 配方樣品對(duì)高糖和高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響Fig.6 Effects of formula samples on glucose utilization in HepG2 cells induced by elevated glucose and free fatty acids

測(cè)定配方樣品對(duì)高糖和高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率的影響，結(jié)果見圖6。當(dāng)加入高濃度葡萄糖與棕櫚酸刺激后，與空白對(duì)照組相比模型組的葡萄糖利用率顯著降低，說明成功建立了胰島素抵抗模型。在添加高濃度葡萄糖和棕櫚酸刺激的同時(shí)，加入不同濃度配方樣品處理，其中實(shí)驗(yàn)組1添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.125 mg/mL樣品溶液，實(shí)驗(yàn)組2添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.250 mg/mL樣品溶液，實(shí)驗(yàn)組3添加了30 mmol/L葡萄糖溶液、0.250 mmol/L棕櫚酸和0.500 mg/mL樣品溶液。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組顯著提高胰島素抵抗肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率。當(dāng)配方樣本終質(zhì)量濃度為0.500 mg/mL時(shí)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率最高，與模型組相比提高了25.63%。結(jié)果表明配方樣品對(duì)高濃度葡萄糖與棕櫚酸聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞造成的胰島素抵抗具有一定的改善作用。

3 結(jié) 論

本文通過對(duì)8種不同植物提取物原料進(jìn)行體外酶抑制率比較，篩選出4種活性較強(qiáng)的提取物原料進(jìn)行配方優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出4種提取物具有交互作用，較佳復(fù)配比例為：枇杷葉提取物41.82%，青錢柳提取物26.05%，葡萄皮提取物10.00%，桑葉提取物22.13%。HepG2細(xì)胞體外模型降血糖效果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示配方樣品可提高高糖誘導(dǎo)以及高糖-高脂聯(lián)合誘導(dǎo)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖利用率，降低細(xì)胞外的葡萄糖濃度，改善胰島素抵抗模型癥狀。

目前，本配方只進(jìn)行了體外細(xì)胞模型評(píng)價(jià)降血糖效果實(shí)驗(yàn)，輔助降血糖功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)有待完善，可望在此配方基礎(chǔ)上，結(jié)合感官評(píng)價(jià)開發(fā)一款輔助降血糖功能性食品。