張軍，王建化

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海都學(xué)院，山東 萊陽(yáng) 265200)

蓮藕是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、健康價(jià)值極高的食品原料[1]，果醋具有多種生理功效[2-4]。本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)來(lái)探究果醋發(fā)酵的優(yōu)良條件，以發(fā)酵pH、菌種接種量以及發(fā)酵初始酒精度的單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵工藝，再進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析優(yōu)化，最終得出較優(yōu)的結(jié)果，對(duì)蓮藕果醋的實(shí)際生產(chǎn)有著較為重要的意義，為蓮藕的開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟出一條更為廣闊的發(fā)展方向。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

蓮藕：蔬菜批發(fā)市場(chǎng)；釀酒曲：湖北宜昌市安琪酵母股份有限公司；醋酸菌種：鶴壁市百惠生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸：均為分析純，煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水：二次去離子水。

1.2 主要儀器

FK-A型組織搗碎機(jī) 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；RH-QB低溫恒溫?fù)u床 常州市金壇博科實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所；BSC-1100 II BA-X生物安全柜 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；LDZH-150KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HI2221專業(yè)實(shí)驗(yàn)室pH/ORP/溫度測(cè)定儀 哈納沃德儀器有限公司；ULUP實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 成都超純科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蓮藕果醋的發(fā)酵流程

蓮藕→勻漿→過(guò)濾→恒溫發(fā)酵(接入釀酒曲)→蓮藕果酒(接入醋酸菌種)→半成品(調(diào)味調(diào)色)→果醋成品。

2.1.1 操作要點(diǎn)

2.1.1.1 原料處理

將原料蓮藕洗凈，切成0.5 cm左右的薄片，待用。

2.1.1.2 勻漿

每100 g原料蓮藕與150 mL蒸餾水加入10 g蔗糖混勻后放入組織搗碎機(jī)中搗碎，直至呈漿糊狀。

2.1.1.3 菌種活化

向配制好的糖液(1 g蔗糖與20 mL蒸餾水混合)中加入2 g釀酒曲在35 ℃下保藏30 min進(jìn)行菌種活化。注意菌種不得包心結(jié)塊。

2.1.1.4 酒精發(fā)酵

控制接種量2%，在無(wú)菌操作臺(tái)上以無(wú)菌操作將活化好的釀酒曲接入處理好的蓮藕勻漿中，搖勻，置于35 ℃生化培養(yǎng)箱中密封發(fā)酵4 d。

2.1.1.5 過(guò)濾

將發(fā)酵好的蓮藕勻漿用干凈的4層紗布過(guò)濾得到濾液。然后蒸餾后用酒精計(jì)測(cè)得酒精度，并用pH計(jì)測(cè)得蓮藕酒的初始pH值。

2.1.1.6 醋酸發(fā)酵

對(duì)蓮藕酒的酒精度(利用無(wú)水乙醇進(jìn)行調(diào)節(jié))與pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)(用NaOH溶液或者HCl溶液對(duì)蓮藕酒的pH進(jìn)行調(diào)節(jié))，進(jìn)行無(wú)菌操作，將制備好的果酒每100 mL分裝于250 mL三角瓶中(裝液量為40%)接入適量醋酸菌種，用搖床進(jìn)行控溫液態(tài)醋酸發(fā)酵。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

采用液態(tài)搖床進(jìn)行果酒醋酸發(fā)酵，轉(zhuǎn)速120 r/min[5]，裝液量40%(250 mL三角瓶)，發(fā)酵溫度30 ℃，將制備好的待發(fā)酵果酒分裝于250 mL三角瓶中進(jìn)行蓮藕果醋醋酸發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)，醋酸發(fā)酵接種量1%、3%、5%、7%、9%、11%；初始pH值調(diào)節(jié)至2.0，3.0，4.0，5.0；初始酒精度7%、9%、11%、13%、15%；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察最適發(fā)酵時(shí)間。

2.3 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以接種量(A)、初始pH值(B)、初始酒精度(C)為自變量，以醋酸發(fā)酵終止后的蓮藕果醋的pH值為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)方案(見(jiàn)表1)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理使用Design-Expert V8.0.6軟件完成[6]。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 接種量對(duì)蓮藕果醋發(fā)酵pH的影響

蓮藕果醋發(fā)酵pH隨接種量的變化見(jiàn)圖1。

圖1 不同接種量下蓮藕果醋的發(fā)酵pHFig.1 The pH values of lotus root vinegar fermentation under different inoculation amount

在初始pH與初始酒精度條件下，蓮藕果醋的pH在接種量1%～7%的范圍內(nèi)呈下降趨勢(shì)，在7%～11%的范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì),接種量為7%時(shí)蓮藕果醋的pH最低。由此可以確定蓮藕果醋發(fā)酵響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中接種量的3個(gè)水平分別是5%、7%、9%。

3.2 初始pH對(duì)蓮藕果醋發(fā)酵pH的影響

蓮藕果醋發(fā)酵pH隨初始pH的變化見(jiàn)圖2。

圖2 不同初始pH下蓮藕果醋的發(fā)酵pHFig.2 The pH values of lotus root vinegar fermentation under different initial pH values

初始pH在2～3之間，發(fā)酵pH的變化量較大；初始pH在3～5之間，發(fā)酵pH的變化量較小，由圖2可知，pH呈現(xiàn)向3～4集中的趨勢(shì)。得知比較適合的發(fā)酵初始pH在3～4之間。由此可以確定蓮藕果醋發(fā)酵響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中初始pH的3個(gè)水平分別是3，3.5，4。

3.3 初始酒精度對(duì)蓮藕果醋發(fā)酵pH的影響

蓮藕果醋發(fā)酵pH隨初始酒精度的變化見(jiàn)圖3。

圖3 不同初始酒精度下蓮藕果醋的發(fā)酵pHFig.3 The pH values of lotus root vinegar fermentation under different initial alcoholicity

初始酒精度在5%～7%之間，蓮藕果醋的發(fā)酵pH隨著初始酒精度的升高呈下降趨勢(shì)；初始酒精度在7%～13%之間，蓮藕果醋的發(fā)酵pH變化平穩(wěn)；當(dāng)初始酒精度為15%時(shí)，酒精度過(guò)高影響發(fā)酵，pH呈上升趨勢(shì)。由此可以確定蓮藕果醋發(fā)酵響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中初始酒精度在7%～13%之間，從經(jīng)濟(jì)以及保持原有產(chǎn)品品質(zhì)的角度考慮，選擇初始酒精度的3個(gè)水平分別是5%、7%、9%。

3.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

3.4.1 響應(yīng)曲面回歸方程建立及參數(shù)分析

采用Design-Expert V8.0.6軟件，按照Box-Behnken組合設(shè)計(jì)，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取初始pH、初始酒精度、接種量3個(gè)因素作為自變量，以蓮藕果醋的發(fā)酵pH作為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic model

注：“*”為P<0.05，表示差異顯著；“**”為P<0.01，表示差異極顯著。

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到蓮藕果醋醋酸發(fā)酵工藝參數(shù)的二次回歸方程(編碼方程)：

Y=3.78+0.050A+0.098B+0.055C-0.035AB-0.030AC+0.025BC-8.500E-003A2+6.500E-003B2+0.12C2。

式中：Y表示蓮藕果醋pH值，A，B，C分別表示接種量、初始pH值、初始酒精度。

進(jìn)行方差檢驗(yàn)驗(yàn)證回歸方程，R2=0.9435，P<0.01說(shuō)明果醋pH(Y)與接種量(A)、初始pH值(B)、初始酒精度(C)存在線性關(guān)系，該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一次項(xiàng)A(接種量)、B(初始pH值)、C(初始酒精度)和二次項(xiàng)C2(初始酒精度)均為極顯著(P<0.01)；二次項(xiàng)A2、B2和交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著，而且失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型具有顯著意義。

3.4.2 醋酸發(fā)酵工藝的響應(yīng)曲面分析

當(dāng)把接種量固定于0水平時(shí)，隨著初始pH值的升高，果醋的發(fā)酵pH值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)初始pH值固定于0水平時(shí)，隨著接種量的升高，果醋的發(fā)酵pH值呈略微上升趨勢(shì)，但是變化平穩(wěn)，可以看出初始pH值與接種量之間的相互影響不顯著，見(jiàn)圖4。

圖4 接種量和初始pH對(duì)蓮藕果醋發(fā)酵pH值影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot of inoculation amount and initial pH value on pH value of lotus root vinegar fermentation

接種量固定于0水平時(shí)，隨著初始酒精度的升高，蓮藕果醋的發(fā)酵pH值先降低后升高，在0～-1水平(酒精度實(shí)際值7%、5%)之間的蓮藕果醋的發(fā)酵pH值最低。當(dāng)初始酒精度固定于0水平時(shí)，隨著接種量的升高，蓮藕果醋的發(fā)酵pH略微升高，變化趨勢(shì)平緩不明顯，所以初始酒精度與接種量之間的相互影響不顯著，見(jiàn)圖5。

圖5 接種量和初始酒精度對(duì)蓮藕果醋發(fā)酵pH值影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plot of inoculation amount and initial alcoholicity on pH value of lotus root vinegar fermentation

當(dāng)初始pH值固定于0水平時(shí)，隨著初始酒精度的升高，蓮藕果醋發(fā)酵pH值先降低后增大，在-0.5～0.5水平(酒精度實(shí)際值6%、8%)之間蓮藕果醋的發(fā)酵pH值較低。當(dāng)初始酒精度固定于0水平時(shí)，隨著初始pH的升高，蓮藕果醋的發(fā)酵酸度呈上升趨勢(shì)，但趨勢(shì)平緩，所以初始pH與初始酒精度之間的相互影響不顯著，見(jiàn)圖6。

圖6 初始pH值和初始酒精度對(duì)蓮藕果醋發(fā)酵pH值影響的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of initial pH and initial alcoholicity on pH value of lotus root vinegar fermentation

3.4.3 醋酸發(fā)酵優(yōu)化工藝參數(shù)及驗(yàn)證

利用Design-Expert V8.0.6軟件確定蓮藕果醋發(fā)酵的最佳組合為：接種量5%，初始pH 3.0，初始酒精度6.49%，對(duì)應(yīng)的果醋發(fā)酵pH響應(yīng)值為3.56。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步對(duì)該工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，蓮藕果醋的實(shí)際發(fā)酵pH為3.71，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差小于5%，表明該數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化蓮藕果醋發(fā)酵工藝調(diào)整是可行的，具有實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面對(duì)蓮藕果醋的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了醋酸發(fā)酵過(guò)程中接種量、初始pH值、初始酒精度與蓮藕果醋發(fā)酵pH值之間的回歸模型，經(jīng)驗(yàn)證，該模型合理可靠，可用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)。使用該模型得到的優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量5%，初始pH值3.0，初始酒精度6.49%，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間3d，果醋實(shí)際發(fā)酵pH為3.71，近似于預(yù)測(cè)值(3.59)。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的初始酒精度為6.49%，與草莓果醋(6%)的酒精度相近[7]。優(yōu)化后的初始pH為3.0，略低于蘋果果醋、藍(lán)莓果醋、獼猴桃果醋的發(fā)酵pH值[8-10]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的接種量為5%，如用于工業(yè)化生產(chǎn)，為了節(jié)約成本可以略調(diào)低接種量、適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間。

在本實(shí)驗(yàn)條件下制得的蓮藕果醋風(fēng)味純正，酸味柔和，無(wú)異味，略帶有蓮藕特有的風(fēng)味，色澤呈黃褐色，富有光澤，符合GB 18187—2000《釀造食醋》及GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的要求。