馮結(jié)鏵，婁華，鐘先鋒*，區(qū)錫敏，耿濤

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；5.佛山農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；6.深圳誠(chéng)致生物開(kāi)發(fā)有限公司，廣東 深圳 518000)

亞麻(Linumusitatissimum)，又稱胡麻，亞科屬亞麻科植物，是世界上最古老的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。我國(guó)是亞麻的主產(chǎn)國(guó)之一，亞麻種植面積和產(chǎn)量?jī)H次于加拿大，主要分布于我國(guó)的西北、華北地區(qū)[2]。亞麻籽(flaxseed)為亞麻的種子，其主要營(yíng)養(yǎng)成分為脂肪(40%～45%)和蛋白質(zhì)(20%～25%)，此外含有較高的膳食纖維和木酚素等成分[3-5]。目前，亞麻籽的加工主要集中在榨油上，榨油后剩余大量的副產(chǎn)物餅粕，大部分當(dāng)成廢棄物處理，其含有的大量蛋白質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分并未被充分利用，造成了資源浪費(fèi)[6]。

研究表明，亞麻籽餅粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)35%以上，其中氨基酸總量超過(guò)15%，氨基酸的組成和比例符合或接近WHO/FAO規(guī)定的適宜人體氨基酸模式的要求[7]。如：亞麻分離蛋白(flaxseed protein isolate)中賴氨酸/精氨酸的比率為0.25，這是心臟健康食品和嬰兒奶粉配方期望的比值[8]。有研究報(bào)道，亞麻籽蛋白生物活性肽具有抗糖尿病、降血壓等功能[9，10]。由此可見(jiàn)，亞麻籽粕有望成為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和氨基酸資源。

目前，植物蛋白質(zhì)的提取方法主要有堿提酸沉法、泡沫分離法、酶法、超聲輔助法等[11-14]。其中，酶法條件溫和，環(huán)境友好，目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、油脂、纖維素等物質(zhì)的提取分離研究。超聲是利用機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，促進(jìn)物質(zhì)的破碎，從而提高產(chǎn)物得率[15]。研究表明，適當(dāng)?shù)某曁幚砜捎行岣邅喡樽哑傻鞍滋崛÷蔥16]。

鑒于亞麻籽粕潛在的高附加值，本文擬采用超聲波處理，結(jié)合雙酶水解方法，對(duì)亞麻籽粕進(jìn)行水解，以水解度為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行水解方案的優(yōu)化，旨在為亞麻籽粕制備功能性短肽、氨基酸提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽粕：深圳誠(chéng)致生物開(kāi)發(fā)有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醛溶液(AR)、NaOH溶液(AR)：天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

ME104型分析天平、FE28-Standard酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SY-2230恒溫水浴鍋 美國(guó)精騏有限公司；JYL-C50T型多功能粉碎機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；Sonics VCX800超聲破碎儀 美國(guó)Sonics公司；L-550低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；安捷倫1260型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 亞麻籽粕前處理

將亞麻籽餅粕粉碎，過(guò)100目篩，得到亞麻籽粕粉末，備用。

2.2 超聲輔助酶法水解亞麻籽粕工藝

稱取一定量的亞麻籽粕粉末，加入蒸餾水配制成底物濃度為3%的樣品溶液，超聲處理10 min,滴加少量NaOH溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH,再加入一定量的復(fù)合酶(堿性蛋白酶∶中性蛋白酶為1∶1)，在設(shè)定的溫度下恒溫水浴酶解，水解結(jié)束后，升溫滅酶(100 ℃下水浴10 min)，自然冷卻，5000 r/min下離心10 min，取上清液測(cè)定水解度。

2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

針對(duì)超聲頻率、加酶量、pH、溫度、水解時(shí)間5個(gè)影響因素，以水解度為考察指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。控制底物濃度為3%，每個(gè)單因素設(shè)置5個(gè)變量，即超聲頻率(5000，6000，7000，8000，9000 Hz)、加酶量(1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)、pH(7.8，8.2，8.6，9.0，9.4)、溫度(35，40，45，50，55 ℃)、水解時(shí)間(2.5，3，3.5，4，4.5 h)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲頻率、加酶量、pH、溫度4個(gè)因素，以水解度為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，其試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2.5 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法[17]：取3 mL水解滅酶后的酶解液，置于200 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水，加入少量堿液調(diào)節(jié)pH為8.20,再加10 mL中性甲醛溶液, 用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)體系pH值至9.20，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V(mL)。

同時(shí)取未酶解相同濃度蛋白質(zhì)溶液3 mL，按上述方法作空白試驗(yàn)，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V0(mL)。DH按下式計(jì)算：

式中：c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V為酶解液消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為空白液消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；0.014為氮毫克當(dāng)量；N為底物樣品總氮含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 超聲頻率對(duì)亞麻籽粕水解度的影響

圖1 超聲頻率對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on the degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著超聲頻率的增大，水解度也逐漸增大，在超聲頻率為7000 Hz時(shí)，水解度達(dá)最大值，隨后隨著超聲頻率的繼續(xù)增大，水解度明顯下降。這是由于超聲頻率增大，空化作用加劇，細(xì)胞壁破裂能力增強(qiáng)，從而增大了分子熱運(yùn)動(dòng)速率，增加了蛋白質(zhì)的溶解度，從而使水解度增加[18]。但當(dāng)超聲頻率超過(guò)7000 Hz時(shí)，可能是由于頻率的繼續(xù)增大，空化趨于飽和，并破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，因此水解度降低。故初步得出最適超聲頻率為7000 Hz。

3.1.2 加酶量對(duì)亞麻籽粕水解度的影響

圖2 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

由圖2可知，隨著加酶量的增大，亞麻籽粕的水解度逐漸提高，酶添加量達(dá)到2.5%之后，繼續(xù)增加加酶量，水解度增加的趨勢(shì)減緩。這是由于酶濃度較低時(shí)，底物過(guò)量，酶與底物接觸充分，隨著酶濃度的增加，水解程度逐漸增大。當(dāng)加酶量達(dá)到一定限度時(shí)，酶分子與底物的結(jié)合趨于飽和，過(guò)量的酶與底物不能充分接觸，因而無(wú)法作用底物，水解度也將趨于平衡[19]。初步得出最適加酶量為3.5%。

3.1.3 pH對(duì)亞麻籽粕水解度的影響

由圖3可知，pH在7.8～8.6范圍內(nèi)，pH越小，越接近中性蛋白酶的最適pH，隨著pH值增大，水解度逐漸下降，這是由于逐漸偏離了中性蛋白酶的最適pH，而未達(dá)到堿性蛋白酶的最適pH。當(dāng)pH>8.6之后，水解度逐漸上升，在pH為9.4時(shí)，水解度達(dá)到最大值。酶與底物均是蛋白質(zhì)，pH會(huì)影響酶和底物分子上氨基、羧基等基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合，進(jìn)一步影響酶對(duì)底物的催化效率。在水解過(guò)程中采用兩種或多種蛋白酶，由于其具有不同作用位點(diǎn)，水解效果會(huì)優(yōu)于運(yùn)用單一酶[20]。初步確定最適pH為9.4。

圖3 pH對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of pH value on the degree of hydrolysis

3.1.4 水解溫度對(duì)亞麻籽粕水解度的影響

圖4 水解溫度對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由圖4可知，亞麻籽粕水解度隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。溫度較低時(shí)酶活也較低，水解速度慢，而當(dāng)溫度升高時(shí)，蛋白酶會(huì)因變性而失活，造成水解度的下降。當(dāng)水解溫度為50 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值，因此初步確定最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

3.1.5 水解時(shí)間對(duì)亞麻籽粕水解度的影響

圖5 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由圖5可知，時(shí)間對(duì)水解度的影響效果不顯著。在2.5～4.5 h范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，亞麻籽粕水解度逐漸提高，但水解度提高的速率較慢。隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，底物濃度會(huì)逐漸降低，當(dāng)酶與底物的作用達(dá)到飽和時(shí)，水解度的變化將趨于平緩。與其他因素(超聲頻率、加酶量、pH、溫度)相比，時(shí)間對(duì)水解度的影響程度較低。由于考察的時(shí)間范圍較窄，可能在此時(shí)間范圍內(nèi)底物濃度降低的速率較慢，從而使水解度的變化不明顯。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化模型的建立

響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過(guò)對(duì)指定的樣本點(diǎn)的集合進(jìn)行有限的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，擬合出輸出變量(系統(tǒng)響應(yīng))的全局逼近來(lái)代替真實(shí)響應(yīng)面[21]。與正交試驗(yàn)相比，該法的優(yōu)勢(shì)在于：可有效減少試驗(yàn)次數(shù)，給出直觀三維立體圖和等高線圖，并可考察不同因素之間的交互作用。

根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取超聲頻率、加酶量、pH、溫度4個(gè)因素，以水解度為響應(yīng)值，建立四因素三水平試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，各組試驗(yàn)的參數(shù)組合及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

續(xù) 表

用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程為：Y=+29.15+0.89A+2.36B+1.18C+1.46D-2.02AB-1.17AC-0.95AD+0.090BC-0.41BD+0.092CD-2.31A2-1.77B2-0.30C2-3.20D2。

表3 方差分析(水解度)Table 3 Analysis of variance(degree of hydrolysis)

注：p<0.001代表極顯著，用“+++”表示；p<0.01代表較顯著，用“++”表示；p<0.05代表顯著，用“+”表示；p>0.05代表不顯著。

由表3可知，模型p值<0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)p值為0.0539>0.05，不顯著，說(shuō)明該模型的選擇是合適的。此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.9811，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9621,說(shuō)明水解度的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度。從對(duì)水解度的影響來(lái)看，一次項(xiàng)B，C，D對(duì)亞麻籽粕水解度的影響均達(dá)到極顯著水平，一次項(xiàng)A對(duì)水解度的影響較顯著，影響順序?yàn)锽>D>C>A，即加酶量>溫度>pH>超聲頻率。交互項(xiàng)AB對(duì)水解度的影響極顯著，AC、AD對(duì)水解度的影響較顯著，而B(niǎo)C、BD和CD對(duì)水解度的影響不顯著。綜上分析可知該模型與實(shí)際情況擬合較好，可應(yīng)用于亞麻籽粕水解工藝的優(yōu)化。

兩因素之間交互作用的3D曲面圖見(jiàn)圖6。等高線的形狀越接近橢圓說(shuō)明兩因素間的交互作用越顯著。

圖6 各因素交互效應(yīng)的響應(yīng)曲面(水解度)Fig.6 Response surface figures of interaction effect of various factors (degree of hydrolysis)

由圖6a可知，pH和水解溫度一定時(shí)，水解度隨加酶量(1.5%～3.5%)增加而增大；隨著超聲頻率的增加，水解度先升高后降低；超聲頻率固定時(shí)，隨著加酶量的增加，水解度逐漸升高。響應(yīng)曲面呈拋物線，且等高線形狀為橢圓，說(shuō)明加酶量和超聲頻率的交互作用顯著。由圖6b可知，水解溫度和加酶量一定時(shí)，隨著pH (7.8～9.4)增大，水解度逐漸增大，隨著超聲頻率的增加，水解度先升高后降低；從等高線形狀可看出超聲頻率和pH的交互作用顯著。由圖6c可知，加酶量和pH不變時(shí)，隨著水解溫度(35～55 ℃)升高，水解度先升高再降低，隨著超聲頻率(5000～9000 Hz)增加，水解度先上升后下降；當(dāng)水解溫度為45 ℃、超聲頻率為6000 Hz時(shí)，水解度最高。由圖6d可知，溫度和超聲頻率一定時(shí)，隨著pH增加,水解度緩慢增大；水解度隨著酶添加量的增加而增大。由圖6e可知，當(dāng)pH和超聲頻率不變時(shí)，隨著水解溫度升高，水解度先逐漸升高后下降；隨加酶量的增加，水解度逐漸升高。由圖6f可知，當(dāng)超聲頻率和加酶量一定時(shí)，隨著水解溫度升高，水解度先逐漸升高后下降；溫度固定時(shí)，隨著pH增加,水解度逐漸增大；當(dāng)水解溫度為45 ℃、pH為9.4時(shí)，水解度達(dá)到最大值。加酶量的等高線比溫度、超聲頻率、pH的等高線密集，說(shuō)明加酶量對(duì)亞麻籽粕水解度的影響較其他因素顯著，與方差分析結(jié)果一致。

3.3 水解試驗(yàn)的優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化后的最佳水解條件是：超聲頻率5924.85 Hz，酶添加量3.47%，pH 9.40，水解溫度47.60 ℃，此時(shí)預(yù)測(cè)水解度31.49%。為方便實(shí)際的操作，將水解條件調(diào)整為超聲頻率6000 Hz，酶添加量3.5%，pH 9.4，水解溫度45 ℃，按此條件進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得水解度為31.72%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.72%，說(shuō)明方程擬合較好，響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶解工藝參數(shù)準(zhǔn)確，具有實(shí)用價(jià)值。

3.4 亞麻籽餅粕水解液氨基酸含量分析

亞麻籽餅粕蛋白水解過(guò)程降解為多肽和游離的氨基酸，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)工藝優(yōu)化后得到的水解液進(jìn)行氨基酸分析，其液相色譜圖顯示了17種常見(jiàn)氨基酸色譜峰的保留時(shí)間及峰面積，見(jiàn)圖7。

圖7 亞麻籽餅粕水解液氨基酸色譜Fig.7 Amino acid chromatography of flaxseed meal hydrolysate

表4 亞麻籽餅粕水解液氨基酸含量Table 4 Amino acid content of flaxseed meal hydrolysate

由圖7和表4可知，亞麻籽餅粕水解液中游離氨基酸為2.85885 mg/mL,其中谷氨酸(Glu)含量最高(5.52694e-1mg/mL)；支鏈氨基酸(Val、Ile和Leu)含量為8.41895e-1mg/mL；芳香氨基酸(Phe和Tyr)含量為5.00378e-1mg/mL。

4 結(jié)論

亞麻籽粕是亞麻籽榨油后的副產(chǎn)物，但其含有的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)并未得到充分利用。蛋白酶可有效催化大分子蛋白質(zhì)水解成小分子的短肽和氨基酸，而水解度是考察蛋白質(zhì)分解程度的重要指標(biāo)之一。為了提高亞麻籽粕的附加值，本文以亞麻籽粕為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了亞麻籽粕的超聲輔助雙酶水解工藝。通過(guò)響應(yīng)3D曲面圖發(fā)現(xiàn)超聲頻率、酶添加量、pH和水解溫度均對(duì)水解度有顯著影響。得到的最佳水解工藝條件為：超聲頻率6000 Hz，加酶量3.5%，pH 9.4，水解溫度45 ℃，此時(shí)亞麻籽粕水解度可達(dá)到31.72%。亞麻籽餅粕水解液中游離氨基酸總量為2.85885 mg/mL。本研究結(jié)果可為亞麻籽粕制備亞麻籽短肽及氨基酸工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供一定的理論依據(jù)。